童星
- 作品数：1 被引量：16H指数：1
- 供职机构：江南大学环境与土木工程学院更多>>
- 发文基金：食品科学与技术国家重点实验室科研基金国家重点基础研究发展计划国家杰出青年科学基金更多>>
- 相关领域：生物学更多>>
- 黑曲霉α-葡萄糖苷酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达被引量：16
- 2009年
- 【目的】以毕赤酵母(Pichia pastoris)KM71为宿主菌表达黑曲霉(Aspergillus niger)SG136 α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)。【方法】以实验室保藏的A.niger SG136总DNA为模板,根据NCBI数据库中A.niger CBS 513.88 α-葡萄糖苷酶的cDNA序列(aglu)设计引物,通过PCR和重叠延伸PCR(overlap-PCR)方法,扩增得到aglu,将其克隆到载体pMD18-T simple vector,测序结果表明,aglu编码960个氨基酸。与A.niger CBS 513.88α-葡萄糖苷酶相比仅有一个氨基酸的差异。将得到的aglu亚克隆到质粒pPIC9K,构建表达载体pPIC9K-aglu,经BglⅡ线性化后电转化P.pastoris KM71,经过MD、YPD/G418平板筛选表型,PCR方法验证,获得分泌表达重组P.pastoris KM71/pPIC9K-aglu。摇瓶培养中通过添加终浓度为1%的甲醇诱导α-葡萄糖苷酶的分泌。【结果】SDS-PAGE显示表达蛋白的大小亚基分子量分别为98kDa和33kDa,阴性对照中没有出现此条带,非变性电泳检验为一条带。制备的粗酶液的酶学性质表明,转苷反应最适pH为5,最适温度为55℃。在最适pH和温度下,反应24h时低聚异麦芽糖的总含量达到最大为26.0%。【结论】黑曲霉α-葡萄糖苷酶在P.pastoris中获得可溶性表达,并证明有一定的转糖苷活性。
- 童星唐秋嵩吴玉飞吴敬陈坚
- 关键词：黑曲霉Α-葡萄糖苷酶克隆毕赤酵母
