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缺失PRD的人FOXP3单克隆抗体的制备与鉴定被引量：1: 2010年; 目的:制备抗脯氨酸富含区缺失的人FOXP3(△PRD-hFOXP3)的单克隆抗体(mAb),为进一步研究人FOXP3各片段功能奠定基础。方法:以纯化的△PRD-hFOXP3重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞Sp2/0进行常规融合,经筛选及克隆化建立2株分泌抗△PRD-hFOXP3的mAb杂交瘤细胞株;利用核型分析、间接ELISA及Western blot分别鉴定了杂交瘤的细胞核型、抗体的效价与特异性。结果:筛选到2株可稳定分泌抗△PRD-hFOXP3的mAb的细胞株,分别命名为1A2和3A11;2株抗体均为IgG1,腹水经ELISA方法测定效价均可达1∶105;Western blot显示这2株杂交瘤分泌的mAb均可与△PRD-hFOXP3蛋白特异性地结合。结论:成功获得2株能稳定分泌特异性抗△PRD-hFOXP3的mAb的杂交瘤细胞株,可用于人FOXP3的进一步研究及相关试剂的研发等。; 黄莺倪爱民陈勋许逊季宝菊王胜军许化溪邵启祥; 关键词：杂交瘤细胞株单克隆抗体

带PTD的小鼠Foxp3 PRD缺失突变体对小鼠脾混合淋巴细胞反应的影响: 2009年; 目的:构建和表达带蛋白转导结构域(protein transduction domain,PTD)的Foxp3(forkhead boxP3)PRD缺失突变体(PTD-ΔPRD)融合蛋白,并探讨其对脾混合淋巴细胞反应的影响。方法:应用PCR技术扩增获得小鼠ΔPRD片段核酸序列,将其分列插入到带PTD的pET28a-PTD和pET28a-PTD-eGFP原核表达载体中,并在大肠埃希菌Rosetta(DE3)中表达融合蛋白,利用镍柱获得并复性融合蛋白;Western印迹鉴定目的蛋白表达的正确性、流式细胞术和Western印迹检测融合蛋白穿膜进入小鼠T淋巴细胞瘤株EL-4细胞中的能力、双向混合淋巴细胞反应分析融合蛋白对T淋巴细胞增殖的影响。结果:融合蛋白可在大肠埃希菌Rosetta(DE3)中表达,并获得了大量纯化的融合蛋白。流式细胞术和Western印迹显示融合蛋白穿越细胞膜进入EL-4细胞核中,混合淋巴反应初步证明融合蛋白具有抑制T淋巴细胞增殖的功能。结论:成功表达小鼠PTD-ΔPRD Foxp3融合蛋白,该融合蛋白能有效进入细胞核内,抑制T淋巴细胞增殖。; 申卫红刘静彭鑫宗杨勇许逊邵启祥; 关键词：蛋白转导结构域 FOXP3

hFOXP3-Δ E251的克隆及在大肠杆菌中的表达: 2010年; 目的:构建和表达带HIV-TAT穿膜序列(Protein transduction domain,PTD)的人FOXP3突变体PTD-hFOXP3-Δ E251,为研究人FOXP3的功能奠定基础。方法:采用逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)方法,从人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)总RNA中扩增得到人FOXP3(hFOXP3)的cDNA,然后再利用重叠PCR技术扩增获得hFOXP3-ΔE251基因实变体片段。将该重组突变体插入表达载体pET28a-PTD中,构建表达质粒pET28a-PTD-hFOXP3-ΔE251,然后转化感受态细菌E.coli Rosetta(DE3),最终采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β -D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达。结果:SDS-PAGE电泳分析发现,经0.5mM IPTG诱导8h后,可高效表达重组的融合蛋白,表达产物以包涵体形式存在。结论:成功制备了带穿膜序列的人FOXP3ΔE251突变体融合蛋白,为更好地研究人FOXP3的功能与特性奠定了实验基础。; 蔺昕许逊宗扬勇邵启祥; 关键词：基因克隆大肠杆菌

两种方式制备的原核表达含TAT蛋白转导域融合蛋白穿膜能力比较被引量：1: 2008年; 目的:联合应用多种技术评价不同方式制备的TAT转导结构域-eGFP-目的蛋白的穿膜效率及亚细胞定位情况,以期建立有效、稳定的高效穿膜蛋白制备方法。方法:诱导表达、纯化包涵体形式融合蛋白,分别进行直接脱盐和透析复性,并与细胞共育,然后通过流式细胞术、激光共聚焦显微镜及免疫印迹法评价融合蛋白穿膜能力。结果:通过透析复性制备的融合蛋白穿膜效率极低;而纯化后直接脱盐的融合蛋白经流式细胞术、激光共聚焦显微镜及免疫印迹等方法分析,表明均具有高效穿膜能力。结论:两种方式制备的融合蛋白均能穿膜,但透析复性制备的蛋白穿膜效率低,且不易定位于细胞核中,影响进一步对该目的蛋白在胞核中生物学行为的研究;而脱盐的变性蛋白具有高效的穿膜效率。; 许逊蔺昕田雨香招倩倩季宝菊刘静夏圣王胜军许化溪邵启祥; 关键词：复性包涵体

原核表达的含PTD-eGFP不同分子质量融合蛋白穿膜能力的比较被引量：1: 2009年; 目的:评价HIV-1 TAT蛋白转导结构域(PTD)携带的不同分子质量融合蛋白的穿细胞膜能力。方法:诱导表达、纯化含PTD-eGFP的不同分子质量的融合蛋白,与细胞共育后,通过流式细胞术、激光共聚焦评价融合蛋白穿膜能力。结果:诱导表达、纯化获得3种含PTD-eGFP的不同分子质量的融合蛋白。流式细胞术和激光共聚焦方法分析发现3种融合蛋白均具有高效穿膜能力。结论:PTD介导融合蛋白的穿膜能力与分子质量无直接关系。; 田雨香许逊蔺昕陈勋宗扬勇招倩倩季宝菊王胜军许化溪邵启祥; 关键词：蛋白转导结构域增强型绿色荧光蛋白分子质量

PTD-Foxp3融合蛋白的表达、纯化及其生物学功能初步研究被引量：6: 2007年; 目的:构建带HIV-1 TAT转录因子的穿膜序列(Protein transduction domain,PTD)的pET28a-PTD-Foxp3原核表达载体,表达纯化PTD-Foxp3融合蛋白,并研究其生物学作用。方法:利用基因重组技术构建pET28a-PTD-Foxp3融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌Rosetta(DE3)中表达融合蛋白,经Ni2+分离柱纯化pET28a-PTD-Foxp3融合蛋白。流式细胞术检测融合蛋白穿越细胞膜进入小鼠T淋巴细胞瘤株EL-4细胞中的能力,并通过混合淋巴细胞反应初步分析融合蛋白抑制T细胞活化增殖的生物学作用。结果:成功地构建了pET28a-PTD-Foxp3融合蛋白表达载体,表达并纯化了pET28a-PTD-Foxp3融合蛋白。通过流式细胞术分析证实pET28a-PTD-Foxp3融合蛋白能有效地进入细胞内;同时经混合淋巴细胞反应证明该融合蛋白能明显抑制T细胞的活化增殖能力。结论:成功表达具有生物学活性的PTD-Foxp3融合蛋白,为进一步研究PTD-Foxp3融合蛋白免疫抑制功能和构建表达人PTD-Foxp3融合蛋白,最终应用于临床疾病的治疗奠定了基础。; 黄莉莉邵启祥张慧许逊宗杨勇陈述申卫红田小雷彭鑫王胜军许化溪; 关键词：免疫抑制

PTD-eGFP-△E250 mFoxp3融合蛋白的表达与穿膜能力鉴定被引量：1: 2009年; 目的:构建、表达并纯化含有蛋白转导结构域(protein transduction domain,PTD)、eGFP的小鼠Foxp3突变体(PTD-eGFP-△E250 mFoxp3)融合蛋白,为研究小鼠Foxp3的功能奠定基础。方法:利用重叠延伸PCR方法构建pET28a-PTD-eGFP-△E250 mFoxp3原核表达载体,并在大肠埃希菌Rosetta(DE3)中表达此融合蛋白,经Ni2+柱纯化,通过流式细胞仪和激光共聚焦显微镜观察其穿膜效率。结果:成功构建了pET28a-PTD-eGFP-△E250 mFoxp3原核表达载体,并表达和纯化了PTD-eGFP-△E250 mFoxp3融合蛋白,流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测结果显示融合蛋白能很好地穿过细胞膜进入细胞内,并定位于细胞质和细胞核。结论:成功制备了具有穿膜活性的PTD-eGFP-△E250 mFoxp3融合蛋白,为更好地研究小鼠Foxp3的功能与特性奠定了实验基础。; 蔺昕宗扬勇许逊田雨香陈勋舒新军夏圣王胜军许化溪邵启祥; 关键词：FOXP3 突变

PTD-mFoxp3抑制小鼠皮肤移植排斥反应的研究被引量：2: 2009年; 目的:研究带有蛋白穿膜结构域的小鼠Foxp3融合蛋白(mouse Foxp3 fusin protein combining with transduc-tion domain,PTD-mFoxp3)对小鼠脾淋巴细胞活化增殖能力和皮肤移植排斥反应的影响。方法:取健康C57BL/6小鼠脾淋巴细胞,在体外经刀豆蛋白A(concanavaline A,ConA)活化,并分别给予环孢素A(cyclosporine,CsA)、不同浓度的PTD-mFoxp3,mFoxp3,PTD-GFP和培养基处理,检测脾淋巴细胞增殖指数。在此基础上进行从Balb/c小鼠到C57BL/6小鼠的皮肤移植试验,将40只C57BL/6受体小鼠随机分为4组,每组10只,分别以PTD-mFoxp3,CsA,0.9%氯化钠注射液(NS),PTD-GFP于手术当天开始连续腹腔注射8天为干预手段。术后第9天各组随机取2只移植小鼠,采集皮片标本,进行组织学检查。其余的8只用于观察移植皮瓣的存活时间。结果:PTD-mFoxp3和CsA相似,与其他处理方法相比明显抑制ConA活化的小鼠脾淋巴细胞增殖指数(P<0.05)。PTD-mFoxp3组,CsA组移植物的存活时间较各对照组显著延长(P<0.05);病理检查显示PTD-mFoxp3组和CsA组移植物淋巴细胞浸润明显轻于各对照组。结论:PTD-mFoxp3能抑制ConA活化的T淋巴细胞的增殖,且具有抑制小鼠皮肤移植排斥反应的作用。; 舒新军季宝菊蔺昕许逊田雨香俆三荣邵启祥; 关键词：免疫抑制移植排斥

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许逊

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