李海忠
- 作品数：8 被引量：37H指数：4
- 供职机构：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室更多>>
- 发文基金：黑龙江省自然科学基金青岛市科技攻关项目中国农业科学院哈尔滨兽医研究所所长基金更多>>
- 相关领域：农业科学更多>>
- Ⅱ型猪圆环病毒Cap蛋白单克隆抗体的制备及特性鉴定被引量：1
- 2010年
- 为了研究PCV2 Cap蛋白的检测方法,试验应用哈尔滨兽医研究所猪传染病研究室猪病分子诊断组已构建的基因工程重组菌NLS-Cap M15,经IPTG诱导表达获得原核表达Ⅱ型猪圆环病毒Cap蛋白,经亲和层析纯化后免疫6周龄Balb/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA筛选获得了3株分泌Cap蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为2C3、2F3、1E10。结果表明:2C3、2F3均属于IgG1型,1E10属于IgG2a亚型,轻链都是κ链;经Western-blot检测,获得的3株单抗均可以特异性的识别Cap蛋白;ELISA检测其腹水效价均为1.0×105;间接免疫荧光检测单抗2C3、2F3、1E10反应均为阳性,表明这3株单抗能够识别PCV2病毒。
- 李海忠符芳张永欣李曦宋淑萍
- 关键词：CAP蛋白单克隆抗体
- 猪瘟病毒野毒株与疫苗株双重SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立被引量：10
- 2010年
- 为建立猪瘟病毒(CSFV)兔化弱毒疫苗(C株)与野毒株的快速鉴别检测方法,本研究根据GenBank登录的CSFV C株与野毒株的E2基因序列差异,设计2对特异性引物,建立了同时检测C株与野毒株的双重SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。应用该方法对CSFV野毒和疫苗株的最低检出量为10拷贝;检测牛病毒性腹泻病毒Ⅰ型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型4种病毒均呈阴性;批内、批间重复试验的变异系数均低于3%。应用该方法检测从黑龙江省各地区猪场采集的600份样品,结果表明野毒株的阳性率为30.5%。该方法可应用于CSFV野毒株和C株的鉴别检测。
- 王伟符芳陈欣李雪松李海忠李曦
- 关键词：猪瘟病毒野毒株C株
- 猪圆环病毒2型衣壳蛋白(Cap)在293T细胞中的亚细胞定位被引量：4
- 2010年
- 猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因编码病毒的核衣壳蛋白(Cap),该蛋白属于病毒保护性抗原,具有重要免疫功能。本研究以PCV2871毒株基因组为模板,用特异性上下游引物扩增获得ORF2基因,利用真核表达载体构建了表达PCV2Cap蛋白的重组质粒pCAGGS-ORF2。采用脂质体将pCAGGS-ORF2转染至293T细胞,用抗PCV2-Cap单克隆抗体对重组质粒转染细胞进行了免疫活性分析和免疫荧光检测,表明Cap蛋白在细胞中获得表达;利用共聚焦显微镜对Cap蛋白在293T细胞中的亚细胞定位观察结果表明,转染24h后可见Cap蛋白的表达随培养时间延长显著增多,72h达到高峰,表达的Cap蛋白主要分布在细胞核中。构建的pCAGGS-ORF2真核表达重组质粒在293T细胞中的表达,为进一步PCV2基因疫苗的研制奠定了基础。
- 符芳李曦李雪松李海忠陈欣王伟魏萍
- 关键词：猪圆环病毒2型核衣壳蛋白亚细胞定位
- PCV2、PPV、PRV、PRRSV和CSFV复合PCR的应用研究
- 采用建立的PCV2-PPV-PRV-PRRSV-CSFV复合PCR检测方法,对山东省不同地区送检的32份临床疑似病料进行PCR检测.结果表明:32份样品中,PCV.2、PPV、PRV、PRRSV和CSFV感染的阳性率分别...
- 李维华任慧英刘文华邹玲温建新李海忠
- 关键词：猪细小病毒猪伪狂犬病毒复合PCR
- 文献传递
- PCV2、PPV、PRV、PRRSV和CSFV复合PCR的应用研究被引量：13
- 2008年
- 采用建立的PCV2-PPV-PRV-PRRSV-CSFV复合PCR检测方法,对山东省不同地区送检的32份临床疑似病料进行PCR检测。结果表明:32份样品中,PCV2、PPV、PRV、PRRSV和CSFV感染的阳性率分别为25.00%、0%、34.38%、71.88%和3.13%;共检出25份阳性病料,阳性率为78.13%,其中PRV-PRRSV双重感染的比例为31.25%,PCV2-PRV-PRRSV三种病原体混合感染的比例为25.00%;用单项PCR检测作对照,结果两者符合率为100%,表明该复合PCR检测方法具有较高的敏感性,可以作为临床上猪圆环病毒2型感染、猪细小病毒病、猪伪狂犬病、猪繁殖与呼吸综合征和猪瘟的病原学快速诊断方法。
- 李维华任慧英刘文华邹玲温建新李海忠
- 关键词：猪细小病毒猪伪狂犬病毒复合PCR
- TTV1与TTV2 SYBR-Green I实时荧光PCR检测方法的建立和应用被引量：9
- 2010年
- 为建立输血性传播病毒(TTV)基因1型(TTV1)和TTV基因2型(TTV2)的检测方法,本研究根据TTV1与TTV2基因的非编码区域序列差异,设计了2对特异引物,建立了鉴别TTV1和TTV2的SYBR-GreenⅠ实时荧光PCR方法。分别进行了特异性、敏感性及重复性检验,结果表明:重组质粒建立的标准曲线相关系数为99%;可以同时鉴别检测TTV1和TTV2,检测PCV2和PRRSV阳性样品均呈阴性,表明该方法具有良好的特异性;最低检出量为10 copies/μL;重复试验结果显示,TTV1组内和组间变异系数分别为0.14%和0.74%;TTV2组内和组间变异系数均为0.13%;检测现地采集的189份样品,TTV1阳性率32.3%,TTV2阳性率6.3%,TTV1和TTV2混合感染的阳性率28.6%。TTV检测方法的建立为猪群TTV病的流行病学调查提供了有效的手段。
- 陈欣符芳王伟李雪松李海忠宋淑萍李曦
- 猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用
- 单克隆抗体技术是1975年由G. Kohler和C. Milstein创立的,其基本原理是通过细胞融合技术,使B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞继承两种亲本细胞的特性,既具有B淋巴细胞分泌专一抗体的能力...
- 李海忠
- 关键词：单克隆抗体PCV2CAP蛋白
- 文献传递
- 高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒感染猪外周血单核细胞cDNA文库的构建
- 2009年
- 为应用CloneminerTMcDNA Library Construction Kit构建高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染猪的外周血单核细胞cDNA文库,以1×105TCID50PRRSV肌肉接种健康猪,攻毒后第3、5、7、9、14、21及28 d分别采集感染猪外周血,分离单核细胞,提取总RNA、mRNA,以mRNA为模板,通过引物Biotin-attB2-Oligo(dT)、SuperScript.ⅡRT合成5′末端具有attB1接头的cDNA。用柱层析方法纯化cDNA,纯化后的cDNA与pDONRTM222载体进行BP重组,于大肠杆菌DH10B转化,进行文库容量测定。结果表明,构建的高致病性PRRSV感染猪外周血单核细胞cDNA文库的库容量为1.36×107CFU,平均插入片段长度大于1 200 bp,重组率为94.3%,为进一步从文库中筛选未知细胞因子及相关基因提供了有效的工具。
- 肖晶符芳李海忠张永欣柴政蔡雪辉宋淑萍李曦
- 关键词：猪生殖与呼吸综合征病毒外周血单核细胞CDNA文库
