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猪全血中IFN-γ、IL-2、TNF-αTaqMan定量RT-PCR方法的建立及对猪瘟疫苗的免疫评价被引量：1: 2013年; 为建立猪相关细胞因子的检测方法,本研究针对GenBank中猪IFN-γ、IL-2、TNF-α的基因设计特异性引物和荧光探针,建立了这3种细胞因子TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法。结果表明,建立的检测方法在101～109拷贝/μL模板范围内具有良好的线性关系,相关系数R2均高达0.999。利用该方法对猪瘟(CSF)活疫苗进行细胞免疫评价,结果显示,CSF疫苗免疫组猪瘟病毒(CSFV)刺激细胞相对于空白对照细胞,IFN-γ、IL-2、TNF-αmRNA表达量在免疫后3 d～10 d之间均显著升高(p<0.05),而IFN-γ在14 d仍保持高水平表达;对照组CSFV刺激细胞和空白对照细胞的3种细胞因子表达量均无明显差异(p>0.05)。以上结果表明,该方法具有高度的特异性、敏感性和重复性,对不同疫苗的细胞免疫反应评价是可靠的。; 汪志艳刘永刚王刚石文达武嘉男涂亚斌姜成刚何玉利韩梓峰李玉明王延群蔡雪辉; 关键词：全血猪瘟活疫苗

猪链球菌7型强弱毒株SBP_bac_5差异表达蛋白的鉴定: 2013年; 前期研究表明细菌胞外溶质结合蛋白家族5(SBP_bac_5)基因在猪链球菌7型(S.suis 7)型强毒株WC0711中表达量高于弱毒株M13中,推测SBP_bac_5为S.suis 7型强弱毒株差异性表达蛋白。为进一步证实该结果,本研究采用real-time RT-PCR技术在基因水平检测S.suis 7型强弱毒株中SBP_bac_5 mRNA的表达量差异,结果显示,强毒株WC0711中SBP_bac_5的mRNA表达量为在弱毒株M13中的4.59倍。将SBP_bac_5的PCR产物克隆于pET-30a中,通过E.coli BL21诱导表达,纯化后的蛋白免疫新西兰白兔制备抗血清检测S.suis强弱病毒株中SBP_bac_5的表达量差异。结果显示,重组蛋白获得高效表达,S.suis 7型强毒株WC0711中SBP_bac_5表达量是弱毒株M13的3.8倍。; 金家民王淑杰高明明王延群李玉明汪志艳石文达刘鹤姜成刚张秀英蔡雪辉; 关键词：猪链球菌强毒株弱毒株

猪源凋亡相关基因SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR方法的建立被引量：2: 2013年; 为检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染的猪胸腺中凋亡相关因子的变化,本研究针对猪TNF-α、TNFR1、FasL、Fas、Bax、Bcl-2、caspase-3基因及内参β-actin基因设计特异性引物,构建含有各自引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测TNF-α、TNFR1、FasL、Fas、Bax、Bcl-2、caspase-3基因的SYBR Green I qRT-PCR方法。结果显示,该方法线性关系好(R2≥0.998),敏感性高,初始模板的检出下限为10拷贝/μL;特异性强,扩增产物形成单一的特异性熔解峰;重复性好,批内、批间重复试验的变异系数均小于3%,具有良好的重复性。本研究为细胞凋亡相关因子变化趋势的研究提供方法。; 李玉明王刚汪志艳刘永刚涂亚斌王淑杰姜成刚王延群蔡雪辉; 关键词：凋亡相关基因荧光定量PCR SYBR

牛α干扰素在毕赤酵母中的高效分泌表达及活性鉴定被引量：4: 2013年; 为高效分泌表达牛α干扰素(boIFN-α),本研究通过人工合成boIFN-α基因,将目的基因克隆至表达载体pPIC9K中,构建重组质粒pPIC9K-boIFN-α,将其电转化于毕赤酵母菌株GS115,利用抗药选择压力G418筛选重组菌,对重组菌诱导表达,取上清进行SDS-PAGE和western blot检测,并优化重组菌的诱导表达条件。结果显示:筛选获得高效分泌表达boIFN-α的重组菌,其最佳诱导条件为:250 r/min,26℃培养,1%甲醇浓度诱导,诱导72 h。上清中目的蛋白表达量最高可达200μg/mL,本研究为boIFN-α在生产中的应用奠定了基础。; 王延群张璐李玉明汪志艳金家民刘永刚王刚王淑杰姜成刚涂亚斌蔡雪辉; 关键词：毕赤酵母分泌表达

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李玉明