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基于CTC-流式细胞仪活性细菌总数的快速检测技术研究被引量：11: 2013年; 以大肠杆菌作为研究对象,建立一种5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride(CTC)染色结合流式细胞仪(CTC-FCM)的方法,以选择性检测水环境中具有代谢活性的细菌总数.该方法的原理是细菌与具有氧化还原性的染料CTC发生反应,形成红色荧光物质,被流式细胞仪特异性识别进而可选择性检测活性菌.研究结果表明,CTC染色的最佳反应条件为:CTC浓度为2mmol·L-1、37℃避光孵育3h.该方法最低检测限为103个·mL-1.通过比较培养法和CTC-FCM方法检测热灭活后的大肠杆菌,结果表明CTC-FCM方法可准确区分活性菌和灭活菌,且与培养法之间具有较好的线性关系(R2=0.9465).应用CTC-FCM方法检测实际样品,结果显示该方法与培养法之间有较好的线性关系(R2=0.8121).本研究建立的CTC-FCM方法可满足饮用水水质标准需求,且检测时间比平板培养法缩短20～40h,可以用于环境水样中活性细菌总数检测.; 林怡雯杨天李丹何苗; 关键词：TETRAZOLIUM 流式细胞仪

水环境中轮状病毒分子生物学检测技术被引量：3: 2007年; 轮状病毒是重要的水介传播病原体,其感染性强,稳定性高,是水环境中危害严重的病原微生物,快速、准确地检测水环境中的轮状病毒对于控制疾病爆发和保障水质公共卫生安全极为重要。本文系统介绍了水环境中病毒浓集方法、核酸提取方法以及分子生物学检测方法,综述了水中轮状病毒浓集和分子生物学检测方法的研究进展,并探讨了分子生物学方法在检测水环境中轮状病毒存在的问题及发展趋势。; 李丹何苗胡秀华施汉昌; 关键词：环境工程轮状病毒分子生物学水环境

基于PMA-定量PCR选择性检测技术的病原菌消毒特性研究被引量：12: 2011年; 建立了一种核酸染料propidium monoazide(PMA)与定量PCR技术联合选择性检测活性病原菌的技术(PMA-qPCR),以大肠杆菌作为模式菌,研究了氯和一氯胺消毒对病原菌的灭活特性.结果表明,PMA染料能够分别去除99.94%和99.99%的来自非活性大肠杆菌和沙门氏菌的DNA,PMA-qPCR技术能够有效区分活性菌与非活性菌;PMA-qPCR技术得到的氯和一氯胺消毒对大肠杆菌的灭活曲线符合一级动力学方程,灭活速率常数分别为2.24 L.(mg.min)-1和0.017 5 L.(mg.min)-1,低于平板培养法得到的灭活速率常数;当大肠杆菌的去除率达到99%时,采用PMA-qPCR技术检测需要的ct值相比于平板培养法从0.6 mg.L-1.min上升到0.9 mg.L-1.min(氯消毒)和从20 mg.L-1.min上升到超过100 mg.L-1.min(一氯胺消毒);随着ct值的升高,常规qPCR的检测结果基本不变,因此常规qPCR不能够反映氯和一氯胺消毒对病原菌的灭活效果.作为一种新的表征消毒特性的检测技术,PMA-qPCR技术有助于更为准确地评价氯和一氯胺消毒对病原菌的灭活效果.; 仝铁铮吴舒旭李丹何苗杨天施汉昌; 关键词：定量PCR 氯消毒

基于CTC-流式细胞仪的病原菌快速检测技术研究: 本研究利用氧化还原型染料CTC与活性病原菌特异性反应,并利用流式细胞仪检测,建立了一种快速检测水中具有呼吸代谢活性病原菌的方法。通过对CTC的浓度及孵育时间等检测条件进行优化，建立CTC-流式细胞仪检测方法,实验结果表明...; 李丹杨天林怡雯何苗; 关键词：病原菌流式细胞仪; 文献传递

基于RT-qPCR选择性检测水中活性病原菌被引量：8: 2012年; 以大肠杆菌和粪肠球菌作为研究对象,研究建立了一种逆转录定量PCR(reverse transcription q quantitative PCR,RT-qPCR)方法,以选择性检测水中活性病原菌.研究结果表明,细菌体内的RNA经过RT-PCR逆转录成cDNA后利用qPCR可定量目的基因拷贝数,对处于稳定生长期的大肠杆菌(培养6～18 h)和粪肠球菌(培养10～38 h)体内的RNA含量进行检测分别为1 copies.CFU-1和7.98×102copies.CFU-1,以此作为细菌定量的依据,达到准确定量检测水体中目的基因RNA拷贝数而确定活性细菌含量的目的.通过3种方法(培养法、qPCR、RT-qPCR)检测热灭活后的大肠杆菌和粪肠球菌,结果表明与qPCR相比,RT-qPCR能够区分1.43 lg copy(大肠杆菌)与2.5 lg copy(粪肠球菌)的非活性菌,进而选择性检测活性病原菌.实际水样底物基质对RT-qPCR方法的影响不大,RT-qPCR与培养法之间有较好的线性相关性(大肠杆菌,R2=0.930,粪肠球菌,R2=0.948),本研究建立的方法可以用于实际水样活性病原菌的检测.; 林怡雯李丹吴舒旭何苗杨天; 关键词：RNA 大肠杆菌粪肠球菌

免疫磁珠分离与实时定量PCR技术联合检测水中轮状病毒的研究被引量：10: 2009年; 建立了一种免疫磁珠分离技术联合实时定量PCR快速定量检测水中轮状病毒的方法.通过制备能够分离水中轮状病毒的特异免疫磁珠,优化分离条件,建立了免疫磁珠分离前处理方法,并与逆转录、实时定量PCR结合,成功用于水中轮状病毒的检测.研究发现,在1 mL水样中加入10μL轮状病毒免疫磁珠、0.25μL Tween 20、孵育2 h可达到较好的分离效果;免疫磁珠可用于3%牛肉浸膏等常用病毒洗脱液中的轮状病毒的分离,表明该分离技术能与已有的病毒浓集方法良好地整合.免疫磁珠分离技术与实时定量PCR联合用于检测水中轮状病毒,全过程需时约5 h,检测限为1×10^4copies/mL（相当于3-4 PFU/mL）,检测结果与细胞病变试验检测结果有良好的线性相关关系（R^2=0.981 6）,表明其能较好地表征水样的病毒感染风险.对接种已知量的轮状病毒的污水处理厂二级出水、再生水、地表水、自来水等水样的实验表明,该法可用于各种水样中轮状病毒的检测.; 杨万何苗李丹施汉昌刘丽; 关键词：实时定量PCR 轮状病毒环境水样

水中轮状病毒实时定量PCR外标准品的构建被引量：17: 2008年; 采用细胞培养和T-A克隆技术,在轮状病毒主要结构蛋白VP7基因序列上设计合成引物,经PCR扩增后将特异性产物连接入pGEM-T-easy载体中,经过酶切鉴定和测序分析获得轮状病毒cDNA标准品.利用常规PCR和实时定量PCR方法对所获得的cDNA标准品进行特异性、稳定性和重复性指标的检验.结果表明,利用此标准品制备的标准曲线具有较高的扩增效率和良好的线性关系（斜率为-3.353,R^2=0.995）;实时定量PCR熔解曲线分析表明,温度在81℃±0.5℃的PCR产物是轮状病毒VP7序列上的特异性产物,表明此标准品是轮状病毒特异性的;同时,所制备的标准品在实时定量PCR检测中具有较大的线性范围（9×10^0～9×10^11copies/μL,每个反应最低可以检测到9个拷贝数的轮状病毒cDNA,表明利用该标准品进行实时定量PCR分析时具有较高的检测灵敏性;此外,该标准品具有较高的稳定性和重复性（3次独立实验CV值在0.2%～0.9%之间）,可长期稳定保存.构建的标准品可用作检测水环境中轮状病毒的实时荧光定量PCR的外标准品.; 胡秀华何苗刘丽李丹施汉昌; 关键词：轮状病毒克隆标准品实时荧光定量PCR

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李丹