漆信桥
- 作品数：8 被引量：18H指数：3
- 供职机构：四川农业大学更多>>
- 发文基金：长江学者和创新团队发展计划国家自然科学基金四川省教育厅资助科研项目更多>>
- 相关领域：农业科学医药卫生理学更多>>
- PRRSV普通株与变异株鉴别诊断RT-PCR方法的建立与临床应用被引量：7
- 2012年
- 通过对GenBank已公布猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)普通株与变异株Nsp2基因序列进行比对分析,设计合成3条引物,建立一步鉴别诊断普通株与变异株PRRSV的RT-PCR检测方法。结果表明,PCR扩增获得的普通株片段大小为267bp,变异株片段大小为180bp。敏感性试验结果表明该方法具有较高的敏感性,能检测到含量为1.5pg的核酸含量;特异性结果表明该方法在同等条件下检测PRV、CSFV、PCV-2、JEV、CPV、TGEV、SIV均为阴性。对2009-2010年送检的100份临床样品进行检测,结果检出26份变异PRRSV,8份普通PRRSV,阳性率为34%;与ELISA抗体检测试剂盒比较,多检出4份阳性样品。表明建立的鉴别诊断PRRSV的RT-PCR检测方法具有敏感性高、特异性强、重复性好的特点,适用于临床针对PRRSV的检测。
- 周丹郭万柱漆信桥韩国全徐志文朱玲
- 关键词：PRRSVNSP2基因RT-PCR
- 携带猪乙型脑炎DNA疫苗减毒沙门菌的构建及其免疫原性被引量：1
- 2011年
- 将乙型脑炎病毒E蛋白主要抗原片段基因串联,构建真核表达载体pCI-EAB。将重组质粒pCI-EAB转染Vero细胞,表达产物通过RT-PCR和间接免疫荧光试验可检测出目的基因的转录与表达。质粒pCI-EAB电转化入减毒猪霍乱沙门菌,观察重组菌的安全性、体内外的稳定性与免疫原性。动物试验表明,重组菌是相对安全和稳定的;重组菌S.C500/pCI-EAB体外培养时,D600值在0.8左右质粒是比较稳定的;以1×108CFU剂量的重组菌S.C500/pCI-EAB口服免疫小鼠,在二免后1周和三免后1周,重组菌抗体水平与S.C500/pCI-neo空载体组差异显著(P<0.01);脾脏淋巴细胞增殖情况显示,重组菌对ConA有显著的反应性,且与对照组差异明显,同时CD3+、CD4+和CD8+T细胞的数量也显著高于对照组(P<0.01)。上述结果初步表明,以减毒沙门菌为载体的猪乙型脑炎DNA疫苗具有良好的安全性、稳定性和免疫原性,为猪乙型脑炎口服活菌疫苗的研制奠定了基础。
- 李云云郭万柱徐志文韩国全林华漆信桥
- 关键词：减毒沙门菌免疫原性
- 猪圆环病毒2型Cap蛋白的表达及在ELISA中的初步应用被引量：5
- 2011年
- 本研究旨在建立以PCV2Cap蛋白为包被抗原的间接ELISA检测方法,构建猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因原核表达质粒pET32a-ORF2并转化至Rosetta菌,在1.0mmol.L-1 IPTG和37℃条件下诱导下,Cap蛋白获得高效表达,Western blot检测证实其具有免疫反应活性,以纯化的蛋白为抗原建立了检测猪圆环病毒2型抗体的间接ELISA方法。结果表明抗原最适包被浓度为2.16μg.mL-1;血清最佳稀释度为1∶40;抗原最佳包被条件为4℃过夜;最佳封闭条件为1%BSA 37℃1h;血清反应时间为37℃30min;酶标二抗最适作用时间为37℃45min;底物最佳反应条件为37℃显色15min。用该方法对四川省184份猪血清样品进行检测,总阳性率为80.98%(149/184),与商品化的PCV2ELISA试剂盒得到的结果基本一致。本试验成功建立了PCV2血清抗体间接ELISA方法,具有较高的敏感性和特异性,可用于大规模的血清学检测。
- 赵玲朱玲郭万柱徐志文漆信桥李凤勤
- 关键词：圆环病毒2型CAP蛋白间接ELISA
- 流行性乙型脑炎病毒E蛋白抗原表位区与猪细小病毒VP2真核表达质粒的构建及免疫效果
- 2010年
- 筛选了3个位于流行性乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白上不同位置的抗原表位区基因,利用重叠PCR方法分别与猪细小病毒(PPV)VP2基因相连。将目的基因定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建了重组质粒pcDNA3.1-EA-VP2、pcDNA3.1-EB-VP2、pcDNA3.1-EC-VP2。将重组质粒在无免疫佐剂参与的情况下免疫BALB/c小鼠,同时设空质粒接种组及PBS缓冲液接种组作为空白对照,采用ELISA法、淋巴细胞增殖试验和流式细胞仪技术分别对抗体水平、脾淋巴细胞转化功能和小鼠外周血中CD3+、CD4+和CD8+T淋巴细胞数进行检测。结果显示,重组质粒pcDNA3.1-EA-VP2、pcDNA3.1-EB-VP2、pcDNA3.1-EC-VP2接种小鼠后,都能诱导小鼠产生JEV、PPV特异性抗体,并且促进脾淋巴细胞增殖。试验组与对照组比较差异极显著(P<0.01);试验组小鼠CD3+、CD4+T淋巴细胞数在首疫后第7天高于对照组(P<0.01),CD8+T淋巴细胞数在首免后第14天高于对照组(P<0.01)。pcDNA3.1-EB-VP2免疫组小鼠的体液免疫和细胞免疫应答水平均高于pcDNA3.1-EA-VP2和pcDNA3.1-EC-VP2免疫组。表明,用JEV E蛋白抗原表位区基因与PPV VP2基因构建的真核表达质粒能够诱导小鼠产生良好的细胞免疫和体液免疫应答。
- 李云云郭万柱林华漆信桥
- 关键词：流行性乙型脑炎病毒猪细小病毒抗原表位
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒SCM株ORF5基因抗原表位克隆表达及其免疫性研究
- 2010年
- 为鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒SCM株(PRRSV-SCM)囊膜糖蛋白GP5的免疫原性,利用RT-PCR方法从PRRSVSCM株ORF5中扩增大小为231bp的目的基因并构建表达载体PET32-GP5,将其转入大肠埃希菌Rosetta,运用IPTG通过条件优化诱导其表达.检测结果表明:最佳诱导条件为IPTG浓度1mmol/L在37℃下作用5h,表达大小约28kU的融合蛋白.通过Western-blot和间接酶联免疫吸附试验检测表达蛋白,结果显示该原核表达的融合蛋白可与PRRSV阳性血清发生反应,证明该蛋白具有免疫反应性.这为将来研制检测试剂盒以及后续研究PRRSV亚单位疫苗提供了重要依据.
- 魏浩澈徐志文漆信桥林华朱玲许雁峰郭万柱
- 关键词：ORF5抗原表位
- 猪乙型脑炎病毒EⅢ与猪细小病毒VP2基因的串联表达及免疫原性被引量：3
- 2011年
- 通过重叠PCR的方法将猪细小病毒(PPV)VP2基因和猪乙型脑炎病毒(JEV)EⅢ基因通过Linker连接,并克隆至真核表达载体pCI-neo,得到重组质粒pCI-VP2-EⅢ。将重组质粒pCI-VP2-EⅢ转染Vero细胞,其表达产物通过RT-PCR和间接免疫荧光试验的方法检测出目的基因的转录与表达。质粒pCI-VP2-EⅢ在无免疫佐剂参与的情况下,免疫6～8周龄的BALB/c小鼠,同时设空质粒接种组,猪细小病毒灭活苗和猪乙脑弱毒苗免疫组及磷酸盐缓冲液接种组作为参比对照。结果表明,pCI-VP2-EⅢ免疫组,在二免后1周产生JEV和PPV的特异性抗体,三免后达到高峰;对ConA有显著的反应性,且与对照组差异明显;通过流式细胞仪检测,CD3+T、CD4+T显著高于猪细小病毒灭活苗免疫组和对照组(P<0.05),略低于乙脑减毒苗免疫组,但CD8+T显著高于其他试验组(P<0.05),这表明pCI-VP2-EⅢ接种后可能主要是以CD8+T淋巴细胞介导的细胞免疫。
- 李云云郭万柱徐志文林华李宇漆信桥
- 关键词：细小病毒乙脑病毒VP2基因核酸疫苗
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒鉴别诊断方法建立及四川分离株全基因文库的构建分析
- 猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome)由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory synd...
- 漆信桥
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测生物信息学
- 文献传递
- 猪细胞巨化病毒四川株MCP基因克隆及其编码蛋白的生物信息学分析被引量：1
- 2011年
- 参照GenBank公布的仅有的日本株猪细胞巨化病毒较大衣壳蛋白(MCP)基因序列(登录号:AB051069)设计2对引物,采用分步克隆的方法,将PCMV MCP全序列克隆入pMD19-T载体进行测序,成功获得了pMD-MCP重组质粒,将所得序列录入到GenBank中(登录号:HQ025802)。测序结果表明,该MCP基因全长4 017bp,共编码1 338个氨基酸;与NCBI上公布的仅有的日本毒株MCP基因的核苷酸同源性为96.8%,氨基酸同源性为94.1%;进化分析显示:PCMV MCP基因与人疱疹病毒6型或7型的MCP基因亲缘关系较近;利用生物信息学软件对蛋白质结构特征进行分析,发现该蛋白含有59个潜在的磷酸化位点,潜在功能强大;亚细胞定位预测结果表明该蛋白主要存在于线粒体中和细胞质中并各占39.1%和26.1%,内质网占17.4%,高尔基体占8.7%,空泡和细胞核均占4.3%,表明PCMV MCP蛋白属于胞质蛋白,抗原区位集中于胞膜,有向胞质移动的趋势;另该成熟蛋白存在18个主要的抗原位点,将肽链经亲水性与抗原表位的共同分析,发现其肽链的C端极有可能分布有抗原决定簇。
- 史小红徐志文郭万柱朱玲漆信桥王燕群赵玲
- 关键词：克隆生物信息学分析
