郭丹华
- 作品数：7 被引量：14H指数：2
- 供职机构：福建医科大学更多>>
- 发文基金：福建省重大科技项目国家自然科学基金福建省高等学校科技创新团队培育计划更多>>
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- 小分子乙型肝炎病毒基因组缺失突变体结构分析被引量：1
- 2008年
- 目的 了解小分子HBV基因组缺失突变体的基因结构及特点。方法 采用一步法PCR从慢性乙型肝炎患者血清中扩增全基因组HBVDNA，回收并克隆〈1kb的小分子HBVDNA，测序并以BioEdit及VectorNTI6．0软件分析基因结构特点。结果获得基因长度介于174～986bp之间的64种、共124个小分子HBV缺失突变体DNA，按基因结构特点分为3类，即3种GT-AG剪接变异体、29种“常规”缺失突变体及32种基因组内部含polyA的缺失突变体。所有小分子基因组缺失突变体在HBV各编码区及基因调控区均存在不同程度缺失，其中66％（42／64种）保留与HBV复制（包装）相关的所有顺式调控序列，48％（31／64种）保留X编码区。结论 乙型肝炎患者血清中普遍存在小分子HBV基因组缺失突变体，深入了解这些变异体的结构和功能，有助于进一步探索HBV的致病机制。
- 郭丹华王林黄清玲林万松陈婉南林旭
- 关键词：肝炎病毒乙型基因缺失聚合酶链反应
- 双剪接型2．2 kb乙型肝炎病毒基因组剪接变异体编码蛋白的反式激活作用被引量：5
- 2006年
- 目的研究双剪接型2．2 kb乙型肝炎病毒(HBV)剪接变异体编码的新蛋白的功能。方法PCR扩增双剪接型2．2kb HBV剪接特异性新基因并克隆于哺乳动物细胞表达载体pcDNA3．1/ HisC。以FuGENE6将此重组载体(pcDNA3．1/HisC-TPds)转染Huh7细胞,采用融合表达的多肽表位(X- press表位)抗体,通过Western blot检测目的蛋白在不同时间段的表达。pcDNA3．1/HisC-TPds分别与β-半乳糖苷酶报告载体psv-β-galactosidase(含SV40启动子/增强子)或pCMVβ(含CMV即刻早期启动子)共转染Huh7细胞,转染后48h裂解细胞并检测胞内β-半乳糖苷酶活性,实验数据以SPSS11．5软件分析。结果克隆420bp双剪接型2．2kb HBV剪接变异体新基因,Western blot显示其在Huh7细胞中表达相应蛋白,以转染后48h为最高。在含有CMV即刻早期启动子或SV40启动子/增强子的报告载体与pcDNA3．1/HisC-TPds质量比为1：10～1：50范围内,共转染有报告载体及pcDNA3．1/HisC-TPds的Huh7细胞内β-半乳糖苷酶活性均大于相应的pcDNA3．1/HisC空白载体对照组,且在1：10～1：40范围内存在剂量-效应关系。结论双剪接型2．2kb HBV剪接变异体编码的新蛋白可反式激活CMV即刻早期启动子及SV40启动子/增强子,提示其可能与HBV致病有关。
- 陈婉南黄清玲林建银王林郭丹华林旭
- 关键词：乙型肝炎病毒RNA剪接反式激活
- 双剪接型2·2kb乙型肝炎病毒基因组剪接变异体编码蛋白可反式激活GAL4反应元件被引量：1
- 2006年
- 为研究双剪接型2.2kb乙型肝炎病毒(HBV)基因组剪接变异体特异性新蛋白—yTPds的功能,以酵母双杂交系统的诱饵质粒pGBKT7克隆yTPds基因并转化酵母细胞AH109获得相应重组子,滤纸法及液相分析法测酵母转化子内β-半乳糖苷酶(-βgal)的活性,证实yTPds蛋白可反式激活酵母GAL4反应元件(GAL4 responsive ele-ment)。在此基础上,为进一步探讨该蛋白反式激活作用的功能区域,以pGBKT7分段克隆yTPds基因,分别编码yTPds蛋白N端47个氨基酸(yTPds-N47)、N端75个氨基酸(yTPds-N75)、中部28个氨基酸(yTPds-M28)、C端92个氨基酸(yTPds-C92)、C端64个氨基酸(yTPds-C64)以及去除中部28个氨基酸的融合蛋白(yTPds-Fusion)。各重组载体转化酵母细胞AH109获得相应转化子。滤纸法定性检测酵母转化子内-βgal活性,结果显示yTPds-N75、yTPds-M28、yTPds-C92蛋白可反式激活GAL4反应元件,液相分析法显示酵母转化子内-βgal活性强弱为yTPds-M28>yTPds-N75>yTPds-C92>yTPds,提示yTPds蛋白反式激活作用的功能区域是其中部28个氨基酸,该区域对应于HBV preS1蛋白反式激活功能域。此研究证实双剪接型2.2kb乙型肝炎病毒(HBV)基因组剪接变异体特异性新蛋白具有反式激活作用,提示其可能具有重要的致病意义。
- 陈婉南郭丹华柏世玉王林林建银林旭
- 关键词：乙型肝炎病毒RNA剪接反式激活GALA反应元件
- 乙型肝炎病毒458nt-1308nt剪接特异性蛋白抗α-干扰素作用被引量：2
- 2008年
- 目的研究乙型肝炎病毒（HBV）458nt-1308nt剪接特异性蛋白TSR′r′（源于HBVDNA聚合酶读码框，T代表TP区，S为Spacer区，R′为截短的RT区，r′为截短的RNaseH区）抗α-干扰素（IFN-α）作用并分析其功能区域。方法PCR扩增获得HBV458nt-1308t剪接变异体剪接特异性基因TSR′r′及其缺失突变体，并克隆于pcDNA3.1／HisC。重组载体以FuGENE6转染Huh7肝细胞，通过融合表达的多肽表位抗体，Western blot检测目的蛋白表达。TSR′r′及其缺失突变体重组载体分别与IFN-α反应报告载体p6-16CAT共转染Huh7肝细胞，转染后48h给予终浓度为100IU／ml的IFN-α2a刺激，作用24h后裂解细胞，检测胞内氯霉素乙酰基转移酶（CAT）含量。所有实验数据采用单因素方差分析法进行统计分析。结果构建TSR′r′及其缺失突变体重组真核表达载体，Western blot显示各基因片段在Huh7细胞中均表达相应蛋白。06-16CAT共转染结果显示，随着TSR′r′重组表达载体转染量的递增，Huh7胞内CAT值逐渐降低。此外，转染TP＋Spacer区的缺失突变体可导致Huh7胞内CAT值显著下降，而其他各类TSR′r′缺失突变体共转染后胞内CAT值无变化。结论HBV458nt-1308nt剪接特异性蛋白抑制Huh7细胞对IFN-α的反应性，其活性与N端的TP及Spacer区有关。
- 王林黄清玲郭丹华陈婉南林建银林旭
- 关键词：乙型肝炎病毒RNA剪接Α-干扰素DNA聚合酶
- DNA肿瘤病毒蛋白致肿瘤机制研究进展被引量：1
- 2007年
- 郭丹华林旭
- 关键词：DNA肿瘤病毒肿瘤病毒蛋白质类突变
- 2.2kb乙型肝炎病毒剪接特异性蛋白对Huh7细胞基因表达的影响被引量：6
- 2008年
- 目的研究单剪接及双剪接型2.2 kb乙型肝炎病毒基因编码剪接特异性蛋白(分别为TPss及TPds)对Huh7细胞基因表达的影响,探讨其可能的致病机制。方法PCR扩增TPss及TPds编码序列并克隆入pcDNA3.1/HisC。采用FuGENE6将重组表达载体及相应空载体分别瞬时转染Huh7细胞,Trizol抽提细胞总蛋白与总RNA。以Westernblot检测目的蛋白的表达,通过Affymetrix Genechip U133 plus 2.0人类基因表达谱芯片检测Huh7肝细胞基因转录的变化并以半定量RT-PCR进一步验证。结果成功构建重组真核表达载体pcDNA3.1/HisC-TPss及pcDNA3.1/HisC-TPds,在Huh7细胞中能分别表达TPss(单剪接)及TPds(双剪接)蛋白。TPss蛋白导致Huh7细胞DGKβ(diacyl-glycerol kinase beta)等4个基因转录上调,ZNF652(zinc finger protein 652)等5个基因转录下降;TPds蛋白导致细胞MTSS1(Metastasis suppressor 1)等3个基因转录上调,WARS2基因(Tryptophanyl tRNA synthetase 2)转录下降。结论2.2 kb乙型肝炎病毒基因组剪接体编码剪接特异性蛋白可能影响肝细胞骨架的重塑、细胞内物质代谢等方面,与肝细胞的增生、迁移及代谢异常密切相关。
- 陈婉南郭丹华陈金烟林万松林建银林旭
- 关键词：RNA剪接
- 乙型肝炎病毒3022～1787核苷酸缺失突变体编码蛋白具有抗α干扰素作用
- 2009年
- 为证实乙型肝炎病毒(HBV)3022～1787核苷酸缺失突变体编码蛋白TS′X′(源于DNA聚合酶读码框架,T为TP区,S′为部分缺失的spacer区,X′为截短的X蛋白)具有抗α干扰素(IFN-α)作用并确定其功能区域,用聚合酶链反应(PCR)扩增获得TS′X′全长及片段TS′(含TP区及部分缺失的spacer区),并克隆于pcDNA3.1/HisC载体。重组质粒以FuGENE6转染Huh7肝细胞,48h后裂解细胞,以蛋白质印迹法(Western blot)证实目的蛋白可在Huh7肝细胞中表达。重组质粒及空载体pcDNA3.1/HisC分别与IFN-α反应报告质粒p6-16CAT按分子数5∶1、10∶1、15∶1、30∶1共转染Huh7肝细胞,转染后48h给予终浓度为100IU/ml的IFN-α2a刺激,作用24h后裂解细胞,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测胞内氯霉素乙酰基转移酶(CAT)含量。结果显示,与空白载体相比,随着TS′X′及TS′重组表达质粒转染量的递增,Huh7胞内CAT值逐渐降低(n=6,P<0.05),但TS′X′与TS′之间无显著差异(n=6,P>0.05)。本研究证实,HBV3022～1787核苷酸缺失突变体编码的TS′X′蛋白可抑制Huh7细胞对IFN-α的反应性,其活性与其N端TP及部分缺失的spacer区有关。
- 王林郭丹华焦伯延林万松林建银林旭
- 关键词：乙型肝炎病毒缺失突变Α干扰素
