刘松
- 作品数：48 被引量：96H指数：5
- 供职机构：江南大学生物工程学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划江苏省自然科学基金更多>>
- 相关领域：轻工技术与工程生物学化学工程文化科学更多>>
- 基于蛋白质折叠自由能分析的定点突变提高谷氨酰胺转胺酶热稳定性被引量：3
- 2018年
- 谷氨酰胺转胺酶(Transglutaminase,EC 2.3.2.13,TGase)广泛应用于食品、纺织等领域。为提高TGase的热稳定性,通过PoPMuSiC-2.1预测了降低Streptomyces hygroscopicus TGase分子折叠能的氨基酸位点,并构建了相应的突变体。PoPMuSiC-2.1预测结果显示,替换P132的氨基酸引起TGase折叠自由能下降的幅度最大。基于此,通过定点突变分别构建了低折叠自由能的突变体P132I、P132G、P132M、P132Q。酶学分析表明,P132I在50℃下的半衰期达到5.0 min,较野生酶提高31%;其它突变体则较野生酶提高2%～13.7%。此外,P132I和P132G比酶活亦分别较野生酶提高24%和12.4%,其它突变比酶活变化不明显。作用力分析发现,突变体P132I中较野生TGase增加两个氢键。上述结果表明,基于蛋白质折叠自由能分析的定点突变能有效地提高TGase的热稳定性与催化活性,氢键的增加可能是P132I热稳定性提高的原因之一。
- 童理明刘松李江华堵国城陈坚
- 关键词：谷氨酰胺转胺酶定点突变热稳定性
- 组合策略促进碱性果胶酶在毕赤酵母中高效表达
- 本研究组合了基因密码子优化及分子伴侣共表达策略提高碱性果胶酶(PGL)在毕赤酵母中的胞外产量.基于Pichia pastoris密码子偏好性,优化了来源于Bacillu sp.WSHB04-02PGL高热稳定性突变体K3...
- 陈双全刘松堵国成陈坚
- 关键词：碱性果胶酶发酵工艺毕赤酵母蛋白表达
- 自组装双亲短肽氨基酸组成及连接肽对其融合酶表达量的影响被引量：2
- 2017年
- 自组装双亲短肽(self-assembling amphipathic peptides,SAPs)是一类亲疏水氨基酸按一定规律分布,具有自聚合效应的氨基酸短肽,融合在酶蛋白N端时,具有促进表达和稳定化的功能。以自组装双亲短肽S1(AEAEAKAKAEAEAKAK)为出发序列,与来源于Bacillus sp.WSHB04-02的碱性果胶酶(alkaline polygalacturonate lyase,PGL)组成的融合酶为模式蛋白,考察SAPs的氨基酸组成及SAPs融合蛋白内部连接肽(linker peptide)对PGL-SAP融合酶的表达量的影响。结果显示,含有较弱疏水性的甘氨酸和丙氨酸残基的PGL-S1突变体可使融合酶正常表达,其中,含有组氨酸的PGL-S1v1具有相对最高的胞外酶活,较野生型提高了9倍,较PGL-S1提高了1.5倍。连接肽方面,与刚性连接肽相比,含有柔性连接肽的融合酶具有更高的胞外酶活,含有(GGGGS)3的PGL-F-S1融合酶胞外酶活是野生型的14倍。上述结果表明,SAPs的氨基酸组成及融合蛋白之间的连接肽对PGL融合酶的表达具有重要影响。
- 赵伟欣刘松刘立明陈坚堵国成
- 关键词：连接肽表达量碱性果胶酶
- 细菌脂肪氧合酶酶学性质分析及表达优化被引量：1
- 2020年
- 脂肪氧合酶(lipoxygenase,LOX)是一类含有非血红素铁的双加氧酶,在食品、医药和化工等行业具有广泛应用。利用Escherichia coli BL21(DE3)重组表达来源于Pseudomonas aeruginosa和Burkholderia thailandensis的脂肪氧合酶PaLOX、BtLOX,并对其酶学性质进行比较分析。通过对酶学性质分析发现:PaLOX、BtLOX的最适反应温度分别为25和35℃;最适反应pH分别为7.0和7.5。PaLOX的K_(cat)/K_m较BtLOX高16.7倍,展现出更好的开发应用潜力。为优化PaLOX的可溶性表达,采取了2种优化策略:首先利用乳糖作为诱导剂代替异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG),使胞内酶活力提高了1.53倍,可溶表达水平提高了2.41倍;进一步与触发因子(triggering factor,TF)融合表达,TF-PaLOX酶活力提高了1.85倍,可溶表达水平提高3.19倍。该研究通过分析细菌来源脂肪氧合酶酶学性质及优化表达条件,为脂肪氧合酶的高效生产及应用提供了重要参考。
- 庞翠萍刘松刘松张国强周景文
- 关键词：脂肪氧合酶酶学性质可溶表达
- 分子改造提高谷氨酰胺转氨酶的催化活性被引量：5
- 2018年
- 谷氨酰胺转氨酶(EC2. 3. 2. 13,Transglutaminase,TGase)是一种重要的食品酶。为提高其催化活性,通过Discovery Studio 2017预测了Streptomyces mobaraense TGase中影响其与底物α-N-CBZ-GLN-GLY结合自由能的氨基酸位点,构建得到结合自由能下降的TGase突变体:Y24W、E300W和Y302R。与野生TGase相比,E300W的比酶活提高了31%; Km、kcat和kcat/Km值分别提高了10%、42%和29%,说明E300W比酶活的提高主要是由于酶转换数的增加。Y24W、E300W和Y302R的热稳定性均有不同程度下降。作用力分析发现,Y24W、E300W和Y302R主链-主链氢键分别减少1、2和4个。上述结果表明,基于蛋白质结合自由能分析的策略能迅速鉴定影响TGase催化活性关键氨基酸,进一步突变能有效提高其催化活性。
- 任蕊蕊刘松李江华堵国成陈坚
- 关键词：谷氨酰胺转氨酶解脂耶氏酵母定点突变酶学性质
- 融合短肽促进碱性果胶酶的高效生产
- 果胶酶(PGL)是一种重要的工业酶,广泛应用于食品、纺织和造纸等行业.本研究将6种双亲短肽(SAP)融合至PGL N端,以期提高PGL在大肠杆菌中的分泌表达效率.最终得到一株高产菌株重组大肠杆菌(表达PGL-S1),胞外...
- 汪明星刘松堵国成陈坚
- 关键词：碱性果胶酶
- 强化解脂亚洛酵母菌体积累产α-酮戊二酸的pH调控策略被引量：3
- 2017年
- 为了促进解脂亚洛酵母(Yαrrowiα lipolyticα WSH-Z06)利用甘油高效生产α-酮戊二酸,比较了pH值对菌体生长和产α-酮戊二酸的影响,通过动力学分析确定了一种通过调控pH值控制菌体浓度促进产α-酮戊二酸的策略,比较了菌体浓度对产α-酮戊二酸的影响.结果表明,发酵初期控制pH为6.0,菌体浓度达10 g/L后pH自然降至3.0保持到发酵结束,α-酮戊二酸产量达54.0 g/L,产量和生产强度分别比以Cα CO3为pH缓冲剂时提高了19.3%和17.8%.
- 张海林方芳刘松曾伟主周景文陈坚
- 饱和突变提高肌酸酶热稳定性被引量：1
- 2019年
- 为提高肌酸酶(Creatinase,EC 3.5.3.3,CRE)的热稳定性,通过序列比对的方法确定了Arthrobacter nicotianae 23710 CRE热稳定性相关位点K195,并对其进行饱和突变。与野生酶相比,突变体K195V、K195T、K195C和K195L在50℃下的半衰期分别提高260%、230%、60%和20%;其中,K195V和K195C比酶活分别提高80.7%和88.2%,其他突变体比酶活无明显变化;突变体K195V、K195T、K195C和K195L的催化效率(kcat/Km)分别提高131%、218%、83%和100%。结构分析发现,突变体K195V、K195T、K195L较野生酶分别增加了7、12和13个氢键。结果表明:对Lys195的突变可有效改变CRE的热稳定性及催化效率,且分子内部氢键的增加可能是CRE热稳定性提高的重要原因之一。
- 阮洁刘松李江华堵国成陈坚
- 关键词：肌酸酶热稳定性分子改造氢键
- 共表达抗氧化酶促进脂肪氧合酶在大肠杆菌中的表达
- 2019年
- 基于脂肪氧合酶(LOX)活性对宿主菌潜在的危害,分别共表达了超氧化物歧化酶和过氧化氢酶,以期提高铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa BBE来源的LOX在大肠杆菌Escherichia coli Rosetta(DE3)中的表达。将P.aeruginosa BBE超氧化物歧化酶基因sodB和sodM及E.coli过氧化氢酶基因katE克隆至pRSFDuet-1,分别得到表达质粒pRSF-sodB,pRSF-sodM和pRSF-katE,将上述表达质粒转化至表达LOX的重组大肠杆菌N6,得到菌株N6-B,N6-M和N6-K。在20℃和1 mmol/mL异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)条件下诱导70 h,N6-B、N6-M和N6-K胞内外LOX总酶活分别为21.6、28.1和7.1 U/mL,其中N6-B和N6-M较对照菌株N6(11.8 U/mL)提高了83%和138%。通过正交实验确定LOX较优的诱导表达条件为:IPTG浓度2 mmol/mL,诱导菌体浓度(OD600)2.5,诱导温度20℃。研究结果表明:共表达超氧化物歧化酶能有效促进LOX在大肠杆菌中的表达,为该酶高效异源表达研究提供了新思路。
- 邱芳芳刘松堵国成陈坚
- 关键词：脂肪氧合酶超氧化物歧化酶过氧化氢酶大肠杆菌共表达
- 重组脂肪氧合酶分子改造被引量：1
- 2014年
- 脂肪氧合酶（Lipoxygenase,EC1.13.11.12,LOX）是一种双加氧酶,它能够专一催化多元不饱和脂肪酸中的cis,cis-1,4-戊二烯结构,通过分子加氢形成具有共轭双键的氢过氧化物。LOX在食品、医药和化工等领域都有广泛的应用,市场需求巨大。但微生物来源的LOX往往具有热稳定性较差的缺点,这限制了LOX在工业加工中的应用,因此提高酶的热稳定性对提高酶的应用价值和降低工业成本具有重要意义。在脂肪氧合酶N端与C端结构域链接处的loop结构（L6）分别插入1～3个L6序列,构建突变体L6 Ⅰ、L6 Ⅱ、L6 Ⅲ。3种突变体均可以在大肠杆菌中正常分泌表达,突变体的二级结构和三级结构与野生酶没有明显差异。L6 Ⅰ、L6 Ⅱ、L6 Ⅲ 3个突变体在50℃下的热稳定性分别是野生酶的2.3倍、3.2倍和4倍,其中突变体L6 Ⅱ、L6 Ⅲ的最适反应温度比野生酶提高了5、10℃。突变体的比酶活分别降低为野生酶的28.7%、57.9%和47.6%,同时其疏水性比野生酶提高了约300%。
- 王广圣徐智刘松陈坚堵国成
- 关键词：重组大肠杆菌脂肪氧合酶分子改造
