李雪平
- 作品数：6 被引量：17H指数：3
- 供职机构：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所更多>>
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- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 流感病毒聚合酶PB1-1蛋白的表达与单克隆抗体的制备被引量：6
- 2009年
- 为制备抗流感病毒(AIV)聚合酶PB1-1蛋白的单克隆抗体(MAb),本研究采用RT-PCR技术扩增H5N1亚型AIV聚合酶PB1部分基因片段,并将其克隆至载体pET-32a,转化至BL21细菌进行重组蛋白表达。靶蛋白经Ni+柱纯化后,western blot分析证实该重组蛋白与AIV阳性血清具有良好的免疫反应性。用纯化的PB1-1蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞融合,采用ELISA方法筛选阳性细胞克隆,连续多次克隆纯化后获得2株能稳定分泌抗H5亚型PB1 MAb的细胞株CGFF10和FGFCE5,2株杂交瘤细胞的细胞培养上清及腹水效价分别为103、103和106、107。2株MAb的亚类均为IgG1。实验证明:所制备的MAb能与H5N1亚型PB1-1抗原发生特异反应,具有免疫活性,从而为PB1结构及功能的深入研究奠定了基础。
- 葛叶邓国华李雪平陈化兰
- 关键词：原核表达单克隆抗体
- 流感病毒聚合酶PA亚单位抗血清的制备被引量：1
- 2009年
- 本研究采用RT-PCR方法从H5N1亚型禽流感病毒(AIV)A/Duck/Zhejiang/11/00中分段及全长扩增PA基因片段,将目的基因定向克隆至原核表达载体pET-32a,经测序验证正确后,获得重组阳性质粒,将重组质粒转化BL21细菌后诱导,实现质粒在大肠杆菌中的表达,重组表达蛋白经Ni+柱纯化后分别与弗氏免疫佐剂乳化成油乳剂苗免疫新西兰大耳白兔,获得抗PA的免疫抗血清。Western blot检测结果表明抗血清与目的蛋白发生特异性反应。同时,将PA全长基因插入真核表达载体pCAGGS,转染293T细胞,通过激光共聚焦显微镜发现,抗血清与PA基因的真核表达产物发生反应,出现特异性荧光,在细胞核与细胞浆中均出现荧光,进一步表明PA亚单位在细胞核与细胞浆均有分布。
- 葛叶邓国华李雪平高玉伟姚秋成唐艳玲陈化兰
- 关键词：禽流感病毒抗血清
- H9亚型禽流感病毒SD96株HA蛋白特异性单抗的制备及鉴定被引量：6
- 2008年
- 本研究用H9N2亚型禽流感病毒分离株A/Chicken/Shandong/6/1996(CK/SD/6/96)免疫6周龄BALB/c雌性小鼠,取免疫后小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合。采用血凝抑制(HI)和ELISA方法筛选阳性细胞克隆,连续多次克隆培养后获得3株能稳定分泌H9亚型HA特异性单抗的细胞株1F4C4、9F12D1、2C5H12。3株阳性杂交瘤细胞的培养上清及腹水对CK/SD/6/96的HI效价分别为26、24、21和212、210、27。特异性试验表明该3株单抗均不与其他主要禽类病毒和其他14个HA亚型的禽流感病毒发生交叉反应。1F4C4和2C5H12抗体亚类为IgG2b,9F12D1为IgG2a。这3株单抗对H9亚型不同抗原群流感毒株有不同程度的中和作用,表现出单抗识别抗原位点的差异性,为进一步研究H9亚型流感病毒的抗原性差异以及抗原识别提供了物质基础和条件。
- 李雪平邓国华田国斌陈化兰
- 关键词：禽流感单抗ELISA
- 检测流感病毒H5亚型抗体竞争ELISA方法的建立及初步应用被引量：4
- 2008年
- 本研究采用灭活的H5亚型禽流感纯化病毒包被ELISA反应板,以辣根过氧化物酶标记的HA蛋白单克隆抗体作为竞争检测抗体,建立了检测H5亚型流感病毒抗体的竞争ELISA(C-ELISA)方法。实验结果表明:抗原最佳包被浓度为8.27μg/mL(1∶800),酶标抗体最佳稀释倍数为1∶800,待检血清最佳稀释倍数为1∶10。对已知阳性样品的检测结果表明,本研究中所建立的竞争ELISA方法的敏感性高于经典的血凝抑制方法(HI)。特异性试验表明该ELISA方法仅能检测H5亚型流感病毒抗体,具有良好的特异性。对临床样品检测表明C-ELISA与HI方法的符合率达到93%以上。该方法可以对不同种属动物血清H5亚型流感病毒抗体进行快速定量的检测,为H5亚型流感病毒流行病学调查与抗体的检测提供了一种快速、方便、敏感的方法。
- 李雪平邓国华高玉伟唐艳玲艾嘉亮葛叶陈化兰
- 关键词：禽流感单抗竞争ELISA
- H9亚型禽流感病毒单抗的制备及其抗原捕获ELISA方法的建立
- 本研究用H9亚型禽流感病毒A/Chicken/Shandong/6/1996(CK/SD/6/96)作为免疫原，免疫6周龄BALB/c雌性小鼠。加强免疫后取脾细胞与SP2/0细胞融合，采用ELISA方法和HI方法筛选，阳...
- 李雪平
- 关键词：H9亚型禽流感病毒单抗ELISA
- 文献传递
- 禽流感病毒PB2亚单位抗血清的制备
- 2010年
- 采用RT-PCR方法分段扩增PB2基因,将目的基因定向克隆至含HisTAG的原核表达载体pET-32a,经序列验证正确后,转化BL21大肠杆菌,诱导表达重组蛋白。靶蛋白经Ni+柱纯化后与弗氏免疫佐剂混合免疫新西兰大耳白兔,获得高效价的抗PB2的抗血清。Western-blot检测结果证实制备的抗血清可与PB2蛋白发生特异性反应。进一步将PB2全长基因准确插入真核表达载体pCAGGS,转染293T细胞表达PB2蛋白,通过IFA检测发现,抗血清与细胞表达的PB2蛋白发生反应,出现特异性荧光,经激光共聚焦检测PB2亚单位只在细胞核中出现荧光,说明PB2亚单位单独表达仅限于细胞核内。上述研究为进一步探索PB2亚单位的生物学特性及其结构与功能研究打下基础。
- 葛叶邓国华李雪平陈化兰
- 关键词：抗血清原核表达真核表达
