自然界中的微生物总是通过各种各样的保护机制,使它们能够与恶劣的环境及侵袭性核酸共存。许多微生物都能通过基于基因序列特异性的方式抵抗核酸入侵。CRISPR(clustered regularly inter-spaced short palindromic repeats)即是属于这种保护机制之一。该位点是由独特的DNA间区间隔开的短的重复序列组成,并与一些被称为CRISPR相关蛋白(CRISPR association protein)的蛋白质共同作用,形成一套完整的自我保护机制。这种高变位点能从外源片段中摄取约36bp的短片段,从而建立可遗传的、DNA介导的"特异性免疫保护机制"。
为建立一种基于细菌16 S rDNA的粪肠球菌PCR检测方法,用于检测临床样本和鉴定分离纯化的细菌,通过比较肠球菌间16 S rDNA的差异,设计了1对特异性引物,并对PCR反应条件进行了优化,对PCR的特异性和敏感性进行了检测。结果显示,粪肠球菌ATCC29212及42个鉴定阳性的临床分离株为PCR阳性,检测结果与16 S rDNA测序的鉴定结果一致,其他种属的4株菌为PCR阴性,所得扩增条带单一且与预期的产物大小一致,测序表明该条带为目的条带;该方法的最小检出量为134 CFU,并能直接对病料进行检测。表明所建立的PCR方法能特异地检测粪肠球菌,且敏感、简易、快捷,适用于实验室的日常检测。
为了获得抗菌肽Dermadistinctin-K并鉴定其生物活性,依据GenBank中的氨基酸序列,使用化学合成和PCR相结合的方法获得了完整的Dermadistinctin-K基因序列;使用表达载体pET-32a(+)构建工程菌;用IPTG诱导融合蛋白表达并优化其表达条件,在IPTG终浓度0.1mmol/L下诱导5h表达量最大;最后用His-tag protein Purification kit纯化了融合蛋白,使用肠激酶酶切获得目的蛋白,并进行生物活性鉴定。分析结果表明,抗菌肽Dermadistinctin-K具有抗菌活性和一定的耐热性,其生物活性与pH值密切相关。
为了解湖南省猪源粪肠球菌临床分离株的耐药性及各耐药基因的分布情况,使用K-B法检测了42株猪源粪肠球菌对11种抗生素的敏感性,采用PCR方法检测了粪肠球菌中8种耐药基因的分布情况。结果显示,湖南省临床分离的42株粪肠球菌对大部分的抗生素高度耐药,对四环素、氯霉素、苯唑青霉素、红霉素、米诺霉素、左氧氟沙星、高浓度庆大霉、高浓度链霉素、环丙沙星、万古霉素、青霉素G的耐药率依次为100%、92.9%、88.1%、83.3%、81%、57.1%、52.4%、47.6%、45.2%、31%、11.9%;耐药基因的检出率为Aac(6)'/aph(2'')97.6%、ant(6)'-Ⅰ90%、aph(3)'-Ⅲ76.2%、tet M 90.5%、erm B 73.8%、Van A 4.8%、Van B 54.8%、Van C 88.1%。从表型与基因型共同分析粪肠球菌的耐药性,发现粪肠球菌的多耐药性严重,其耐药表型与耐药基因并不完全一致。
