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构建survivin shRNA重组载体及靶向下调PC3细胞survivin mRNA的表达被引量：3: 2011年; 背景:survivin基因特异性表达于肿瘤和胚胎组织,与肿瘤细胞的分化增殖、浸润转移以及多药耐药密切相关。目的:构建靶向survivin基因的shRNA重组质粒表达载体,转染前列腺癌细胞PC3,验证该载体能否下调细胞survivin基因mRNA水平。方法:以survivin基因为靶点设计具有短发夹结构的shRNA序列,经退火成互补双链后克隆入pENTR/U6建立重组表达载体pENTR/U6-SUR;转化E.coliTOP10菌株,挑取阳性菌落进行菌落PCR和测序鉴定;将重组质粒转染前列腺癌细胞株PC3细胞,RT-PCR检测重组质粒对细胞survivin基因mRNA水平的抑制效果。结果与结论:将设计合成的shRNA序列经退火后克隆至pENTR/U6载体中,菌落PCR可扩增出目的条带,测序结果证实插入片段为所需序列;pENTR/U6-SUR重组质粒转染后PC3细胞survivin基因mRNA表达水平显著下降,且24h比48h作用更明显。成功构建了靶向survivin基因的shRNA质粒表达载体,并证实该载体显著下调了PC3细胞中survivin基因mRNA水平。; 徐建华陈丹娜何敏黄宪章庄俊华黎美贤金小宝卢雪梅朱家勇; 关键词：短发夹RNA SURVIVIN基因前列腺癌细胞

自身抗体检测质量控制专家共识: 2023年; 自身抗体是自身免疫病的重要生物标志物,在疾病的诊断、鉴别诊断、活动性评价和预后评估等发挥关键作用。规范自身抗体检测质量控制对于准确地报告相关检验结果具有重要意义。国家皮肤与免疫疾病临床医学研究中心(北京协和医院)实验诊断研究委员会、中国医师协会风湿免疫科医师分会自身抗体检测专业委员会、国家风湿病数据中心于2023年组织相关临床和实验室专家,依据国家标准、行业指南,结合国内实际情况及自身抗体检测质量控制经验制定了本共识,旨在规范我国相关实验室自身抗体检测质量控制工作。; 国家皮肤与免疫疾病临床医学研究中心(北京协和医院)实验诊断研究委员会中国医师协会风湿免疫科医师分会自身抗体检测专业委员会国家风湿病数据中心曾小峰胡朝军邓垂文周仁芳何敏杨滨李晞; 关键词：自身抗体

CLSI EP7-A2文件在临床化学分析干扰试验中的应用评价被引量：24: 2010年; 目的探讨美国临床实验室标准化协会(CLSI)EP7-A2文件在临床化学分析干扰评价试验中的应用价值。方法根据CLSI EP7-A2文件,利用已开发上市的干扰试剂盒对前白蛋白(PA)进行干扰评价试验。结果配对差异实验结果显示0.2 g/L游离胆红素(FBil)、0.4 g/L结合胆红素(CBil)和2.41 g/L血红蛋白(Hb)对PA测定无干扰,835浊度的乳糜对PA测定有负干扰。5个浓度系列的剂量效应实验结果显示乳糜浊度对PA测定可产生线性负干扰。结论依据EP7-A2文件,利用已开发上市的干扰试剂盒,应用医学统计软件统计分析,是一个具有一定应用价值的分析干扰评价方法。; 徐建华何敏柯培锋吴晓宾王云秀黄宪章庄俊华

VITEK2筛选鲍曼不动杆菌产头孢菌素酶可靠性评价: 2011年; 目的验证和评价VITEK2高级专家系统（AES）判定鲍曼不动杆菌产头孢菌素酶AmpC的可靠性。方法首先收集2009年l～8月经VITEK2的AES判定为产AmpC酶鲍曼不动杆菌，用AmpC纸片法进行确证试验，最后用聚合酶链反应验证阳性株是否存在AmpC基因。结果15株AES判断为产AmpC酶的菌株，经AmpC纸片法确证试验为阳性，其中12株阳性产酶株可以检测到AmpC基因。132株AES判断为不产AmpC酶的菌株中，经AmpC纸片法验证均为阴性。结论VITEK2AES可以很好地预测鲍曼不动杆菌产AmpC酶情况，有助于快速、准确地检测鲍曼不动杆菌这一相关耐药机制，为临床治疗多重耐药鲍曼不动杆菌提供更有力的支持。; 蓝锴邓光远何敏林海标张文庞雪云唐小龙; 关键词：鲍氏不动杆菌头孢菌素酶耐药机制

应用Gateway技术构建pLenti6-Akt shRNA真核表达载体被引量：1: 2012年; 目的应用Gateway技术构建靶向人Akt基因的shRNA真核表达载体,转染肝癌细胞株HepG2,验证该载体能否下调Akt基因的mRNA水平。方法以Akt基因为靶点设计两条具有短发卡结构的shRNA序列,经退火成互补双链后克隆入pENTR/U6入门表达载体(pENTR/U6-Akt1,pENTR/U6-Akt2);转化E.coliTOP10菌株,挑取阳性菌落进行菌落PCR和测序鉴定;利用Gateway技术进行LR位点特异性重组,将shRNA导入目的表达载体pLenti6/Block-it DEST Vector,再行测序鉴定(pLenti6-Akt1,pLenti6-Akt2);将重组质粒转染肝癌细胞株HepG2,提取RNA,RT-PCR检测重组质粒对mRNA水平的抑制效果。结果经菌落PCR和DNA测序鉴定:pENTR/U6-Akts入门载体和pLenti6-Akts目的表达载体中插入片段的序列正确,RT-PCR结果表明将shRNA分别转染HepG2细胞后,Akt的mRNA表达受到明显抑制,其中1#shRNA比2#shRNA抑制效果明显。结论利用Gateway技术成功构建了靶向人Akt基因的shRNA表达载体,为以Akt基因为靶点的肝癌基因治疗方案奠定了实验基础。; 何敏赵学芹李曼庄俊华黄宪章; 关键词：AKT基因短发卡RNA GATEWAY HEPG2细胞

罗氏Cobas e601检测梅毒螺旋体抗体的方法学性能评价被引量：3: 2016年; 目的：对罗氏Cobas e601全自动电化学发光免疫分析仪检测梅毒螺旋体（TP）抗体进行性能评价。方法利用CLSI系列文件（EP5-A2、EP6-A2、EP10-A2）对TP抗体检测的精密度、线性、携带污染率进行确认实验。结果两个试验样本浓度的批内精密度（CV）分别为1.1%和1.2%，日间精密度分别为2.2%和3.1%，均小于5%；线性分析中，稀释浓度样本重复测定的不精密度为1.2%，检测方法为非线性，最适拟合模型为二次多项式，第二个稀释浓度的非线性偏离为10.9%，超过7.5%的允许范围，其他稀释浓度的线性偏离均在允许范围内；携带污染率为0。结论罗氏Cobas e601对TP抗体的检测结果重复性好、携带污染率低，为非线性方法，试剂性能评价良好，能够满足临床要求。; 黄妩姣李思黄宪章何敏曹楠楠; 关键词：电化学发光免疫分析梅毒螺旋体抗体性能评价

多重微珠流式免疫荧光法检测系统性红斑狼疮患者自身抗体的价值: 2022年; 目的探讨多重微珠流式免疫荧光法检测系统性红斑狼疮(SLE)患者自身抗体的结果和应用价值。方法选取2020年10月-2021年3月广东省中医院大学城医院门诊或住院确诊为SLE的患者46例(试验组),健康体检者30名(对照组),利用多重微珠流式免疫荧光法和免疫印迹法检测自身抗体并分析结果,包括抗组蛋白抗体、抗着丝点抗体、抗U1核糖核蛋白(U1-RNP)抗体、抗Sm抗体、抗SSA抗体、抗SSB抗体、抗拓扑异构酶(Scl-70)抗体、抗组氨酰转运核糖核酸合成酶(Jo-1)抗体、抗双链DNA(dsDNA)抗体。结果试验组采用多重微珠流式免疫荧光法和免疫印迹法检测抗核抗体谱(ANAs)阳性率分别为73.9%和80.4%,差异无统计学意义(χ^(2)=0.80,P>0.05);但抗U1-RNP抗体阳性率分别为28.2%和47.8%,差异有统计学意义(χ^(2)=4.97,P<0.05)。利用多重微珠流式免疫荧光法检测SLE患者和健康体检者ANAs,其中抗组蛋白抗体、抗U1-RNP抗体、抗Sm抗体、抗SSA抗体、抗SSB抗体、抗Scl-70抗体、抗dsDNA抗体水平比较差异均有统计学意义(P均<0.05),抗着丝点抗体和抗Jo-1抗体水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论多重微珠流式免疫荧光法可以一次性同时进行多种自身抗体的联合检测,且用该方法与现有常规方法检测SLE患者自身抗体具有一致性,能为临床提供良好实验室数据。; 肖倩杨瑶赵婵静陈茶何敏柯培锋刘健平; 关键词：系统性红斑狼疮自身抗体免疫印迹法

ImageJ软件在重组质粒pET32a-CDK2中蛋白表达的应用被引量：7: 2014年; 目的应用Image J软件探索细胞周期依赖性蛋白激酶2(CDK2)在重组质粒pET32a-CDK2中的蛋白表达条件。方法将重组质粒pET32a-CDK2转入表达菌株BL21(DE3),然后在不同时间点(0、1、2、3、4h)和不同浓度(0.5、1、2 mmol/L)异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)下诱导表达目的蛋白CDK2,对CDK2采用SDS-PAGE法进行蛋白电泳,并应用Image J软件对电泳条带进行灰度分析。结果 CDK2诱导表达量在不同时间点差异有统计学意义(P<0.001),其中0h与1h、2h、3h、4h诱导表达量的差异均有统计学意义(P=0.007,P<0.001,P<0.001,P<0.001);1h与3h和4h诱导表达量的差异均有统计学意义(P=0.001);而2h和1h、3h、4h诱导表达量的差异均无统计学意义(均有P>0.05);不同浓度IPTG下的CDK2诱导表达量差异无统计学意义(P=0.336,P=0.240,P=1.000)。结论根据Image J软件分析结果,采用0.5 mmol/L浓度IPTG 2h的条件,节约诱导时间和试剂用量。; 陈炜烨刘冬冬徐建华陈丹娜何敏张战锋黄宪章; 关键词：IMAGE 原核表达

分析和评价强生Vitros 5.1 FS生化仪的精密度和正确度被引量：8: 2014年; 目的分析和评价Vitros 5.1FS生化分析仪的测量精密度和正确度。方法根据CLSI EP15-A2及其他相关文献,对强生Vitros 5.1FS生化分析仪17个常用生化指标精密度和正确度分析性能进行评价,结果与厂商声明的性能或公认的质量目标进行比较。结果精密度结果显示,Swithin(Stotal)均小于σwithin(σtotal),符合精密度性能要求。参考物质提供的定值均在测量结果的验证区间内。结论强生Vitros 5.1FS生化分析仪17个常用生化指标测量的精密度和正确度符合质量目标要求。; 林海标范雪莲王建兵林莉郑松柏柯培锋何敏万泽民徐建华; 关键词：精密度性能评价

神经元素3与成对盒基因4促进胰腺十二指肠同源框蛋白1诱导间充质干细胞向胰腺分泌细胞分化被引量：2: 2011年; 目的:探索神经元素3(neurogenin 3,NGN3)与成对盒基因4(paired box gene 4,PAX4)对胰腺十二指肠同源框蛋白1(pancreatic and duodenal homeobox factor1,PDX1)驱动间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)向胰腺β细胞分化过程中的作用。方法:构建PDX1基因及NGN3与PAX4双基因表达腺病毒,重组腺病毒Adxsi-CMV-PDX1感染诱导MSCs1周后,再行重组腺病毒Adxsi-CMV-NGN3/CMV-PAX4感染诱导MSCs;分别检测PDX1、PAX4、NGN3、NK转录因子相关的2.2(NK transcription factor related,gene family 2,locus2,NKX2.2)、v-maf muscu-loaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog B(MafB)、胰岛素(Insulin)、胰高血糖素(Glucagon)多种胰腺分泌细胞相关分子表达情况。结果:成功构建腺病毒Adxsi-CMV-PDX1与Adxsi-CMV-NGN3/CMV-PAX4;MSCs经Adxsi-CMV-PDX1与Adxsi-CMV-NGN3/CMV-PAX4分步诱导后,免疫细胞化学与间接荧光检测显示PDX1、NGN3与PAX4因子在细胞核内稳定表达;重组腺病毒稳定转染5 d后,细胞开始变圆并集聚成团,用双硫腙(dithizone,DTZ)染色细胞质呈亮红色;细胞经诱导1周后,用RT-PCR检测到神经源分化因子1(neurogenic differentiation 1,NruroD1)与NKX2.2表达,2周后可检测胰岛素/胰岛素原分子;间接荧光检测显示诱导后的细胞先后开始表达NKX2.2、MafB等转录因子与胰岛素/胰岛素原、胰高血糖等胰岛分泌细胞相关分子,但未能检测到v-maf musculoaponeurotic fibro-sarcoma oncogene homolog A(MafA)与C肽分子表达。结论:NGN3与PAX4对PDX1诱导间充质干细胞向胰腺分泌细胞分化具有促进作用。; 唐小龙肖瑞王云秀何敏谢婷张成刘思景; 关键词：间质干细胞胰腺

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何敏

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