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辽宁部分地区宠物犬犬瘟热病毒分子流行病学调查与分析被引量：5: 2018年; 为了解犬瘟热病毒（CDV）遗传变异情况，先后从辽宁省沈阳、锦州、辽阳等地区的9个宠物医院收治的临床疑似犬瘟热（CD）病犬中采集了165份拭子样品及组织病料。利用CD抗原检测试纸条、RT—PCR检测方式筛选到8份阳性样品。H基因序列分析结果显示该8株CDV野毒株之间的H基因同源性为97．6％-99．9％，与疫苗（Onderstepoort）同源性为89．1％-90．9％；基因遗传进化显示，该8株毒株属于国内当前流行的Asia-1型，来源于沈阳的SY-35株与在北京发现的CDV强毒株BJ—09在同一进化分枝，其余来源于沈阳、锦州和辽阳的7株与东北地区流行的CDV在同一进化分枝；氨基酸序列比对结果显示，H蛋白在氨基酸235-245，415-425，595-605等处存在高变异，H蛋白3555位置氨基酸的非同义置换概率相对比较高；糖基化位点以及抗原表位预测分析显示该8株CDV的H基因糖基化位点和抗原表位方面均与Asia-1型CDV野毒株相似，但与疫苗株相比变异较大，特别是我们发现JZ-6株丢失了1个潜在N-糖基化位点。结果表明：辽宁地区宠物犬CD流行以Asia-1型CDV为主，不同病毒株间存在遗传多样性。; 赵梓淇宫语晨闫飞虎黄培刘静刘静王琪张醒海赵永坤赵永坤高玉伟冯娜; 关键词：犬瘟热病毒 H基因克隆遗传进化

MERS-CoV S1蛋白的表达及鉴定被引量：2: 2018年; 目的真核表达具有天然构象的中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)S1蛋白,并进行免疫反应性鉴定。方法以pcDNA3.1-S重组质粒为模板,PCR扩增S1基因,连接至pFastBac1质粒,构建重组质粒pFB1-S1。将pFB1-S1转化至DH10Bac感受态中,构建重组杆粒BpFB1-S1,然后转染sf9细胞获得重组杆状病毒rpFB1-S1并连续传代。将第四代rpFB1-S1接种sf9细胞后悬浮培养96h,取上清,用PEG8000浓缩并进行免疫亲和层析纯化,采用SDS-PAGE和Western blot鉴定其分子质量及免疫反应性;另取感染rpFB1-S1 48h的sf9细胞进行IFA鉴定。结果 S1基因PCR扩增产物大小为2 212bp,与预期相符。重组质粒pFB1-S1经酶切和测序分析鉴定构建正确。重组杆粒BpFB1-S1经PCR鉴定构建正确。IFA试验可见感染rpFB1-S1的sf9细胞出现特异性绿色荧光,即有目的蛋白表达。SDSPAGE显示纯化的重组S1为单一100×103(Mr)蛋白条带,Western blot检测该蛋白能被鼠抗S-RBD蛋白单克隆抗体识别。结论成功表达了具有免疫反应性的MERS-CoV S1蛋白,为MERS-CoV快速诊断方法的建立及候选疫苗的构建奠定了基础。; 胡星星邱泊宁迟航迟航王翀王化磊金宏丽王翀冯娜盖微微高玉伟金宏丽杨松涛黄培; 关键词：S1蛋白纯化

长春地区犬细小病毒VP2基因的遗传进化及基因型分析被引量：1: 2020年; 目的了解吉林省长春地区犬细小病毒(Canineparvovirus,CPV)的流行及VP2基因的遗传进化特征。方法通过比对GenBank中已收录的不同地区、不同时间的CPV毒株基因序列,筛选保守区,设计特异性扩增完整VP2基因的通用型引物,采集疑似犬细小病毒病的犬粪便样品15份,提取DNA,PCR扩增获得完整的VP2基因并测序。将15份样品的测序结果与GenBank中已收录的22株CPV的VP2基因进行同源性比对并构建进化树,分析亚型以及遗传进化情况。结果PCR检测15份样品均为CPV阳性。样品株与参考株的核苷酸同源性为98.7%~99.9%,与4株商品化疫苗株的核苷酸同源性在98.1%~98.9%,遗传进化分析显示,15个分离株均为CPV-2c亚型,且所在分支十分接近,但未与所选CPV-2c亚型参考株在同一分支上。结论长春地区CPV流行亚型由CPV-2a、CPV-2b逐渐转变为CPV-2c,表明CPV-2c亚型的流行性越来普遍,CPV遗传变异趋势的监测和新型疫苗的研发应得到更多关注。; 莫若黄培张颖张胜男魏世萌王振山裴志花王开赵永坤; 关键词：犬细小病毒 VP2基因基因型遗传进化

寨卡病毒研究进展被引量：3: 2017年; 寨卡病毒病是由寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)感染引起的一种新病毒病。寨卡病毒为黄病毒的一种,由伊蚊属蚊子传播,对成人不会造成生命危险,但其与罕见的格林巴利综合征(Guillain-Barre syndrome,GBS)及新生儿小头症有关,因此,与全世界的公共卫生健康息息相关。起初该病仅在非洲地区流行,1980年传入东南亚,2007年传入密克罗尼西亚,于2014年传入美国并呈现出扩大蔓延趋势,引起世界卫生组织高度重视。2016年,在我国确诊了ZIKV输入性感染病例。本文就ZIKV的分子生物学特征、传播途径、流行病学、临床症状、诊断、预防等方面作一综述,为其相关研究提供参考。; 闫飞虎黄培李恩涛赵永坤杨松涛; 关键词：格林巴利综合征疫苗

中东呼吸综合征冠状病毒量子点免疫层析试纸的制备被引量：3: 2018年; 目的制备一种能快速检测中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)的量子点免疫层析试纸,以期用于MERSCoV感染检测。方法采用EDC偶联法将羧基化CdTe/ZnSe量子点与抗MERS-CoV RBD的单克隆抗体(mAb/MERS-CoV)共价偶联,通过斑点免疫印迹检验偶联物的活性。以CdTe/ZnSe量子点标记的mAb/MERS-CoV作为荧光标记物,采用免疫层析技术制备量子点免疫层析试纸,用于MERS-CoV检测。并对该方法进行特异性、敏感性评价。结果 CdTe/ZnSe量子点可偶联mAb/MERS-CoV,且偶联物具有良好的生物活性。以其作为荧光标记物建立的量子点免疫层析试纸可特异性检测MERS-CoV假病毒,最低检测限为2×53 TCID50/ml,其他对照病毒检测均阴性。结论制备的MERS-CoV量子点免疫层析试纸具有简便、快速、特异等优点,可用于MERS-CoV感染快速诊断和流行病学调查。; 黄培韩秋雪胡星星胡星星曹增国迟航赵永坤冯娜高玉伟王化磊杨松涛夏咸柱; 关键词：量子点

裂谷热研究进展被引量：2: 2019年; 裂谷热(Rift Valley fever,RVF)是由裂谷热病毒(Rift Valley fever virus,RVFV)引起的发热性人兽共患病,该病导致反刍动物的大面积死亡及人类的致命性出血热。RVF最初仅流行于非洲东部地区,现正在逐步扩大。2016年我国确诊首例输入性病例,提示非流行地区和国家正在面临威胁。RVF的流行不仅严重影响人类的健康及畜牧业的发展,更可能被用作潜在生物战剂,因此被世界动物卫生组织列为必须报告疫情。本文对RVF的流行病学、分子生物学、检测技术及疫苗研究进展等方面进行简要综述,为今后RVF的相关研究提供参考。; 毕津豪闫飞虎黄培赵永坤杨松涛; 关键词：流行病学分子生物学疫苗

狂犬病病毒(RABV)感染小鼠原代神经元细胞对Bif-1蛋白表达的影响: 2021年; 建立狂犬病病毒(rabies virus,RABV)CVS-11株感染小鼠原代神经元细胞模型,探究RABV感染小鼠原代神经元细胞对Bif-1(Bax-interacting factor-1)蛋白表达的影响。分离并培养小鼠大脑皮质原代神经元细胞,通过间接免疫荧光鉴定RABV感染效率。将RABV以MOI=0.1剂量接种原代神经元细胞,使用直接免疫荧光、Western blot、RT-PCR等方法检测RABV在原代神经元细胞中的复制情况。利用Western blot检测RABV感染原代神经元细胞后Bif-1蛋白的表达情况。结果成功分离了小鼠大脑皮质原代神经元细胞;直接免疫荧光、Western blot、RT-PCR结果显示,RABV CVS-11株可感染原代神经元细胞;Western blot结果表明RABV感染后,原代神经元细胞中Bif-1蛋白水平早期出现短期上升后降低,且整体低于正常水平。RABV CVS-11感染原代神经元细胞后,Bif-1蛋白水平发生改变,为进一步探索Bif-1蛋白在RABV致病中的作用及其分子机制奠定基础。; 李武建金宏丽焦翠翠时智康张颖黄培伊淑帅闫飞虎赵永坤高玉伟杨松涛王化磊夏咸柱; 关键词：小鼠

委内瑞拉马脑炎病毒E2蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备被引量：1: 2017年; 原核表达并纯化委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus,VEEV)E2蛋白胞外区,并以此为抗原免疫动物制备多克隆抗体。利用PCR扩增VEEV E2蛋白胞外区基因并将其插入到原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒pET-30a(+)-VEEV-E2,转化至大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白表达。优化诱导条件并对目的蛋白进行亲和纯化,用纯化后的蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,通过间接免疫荧光方法检测抗体的结合能力。通过PCR扩增出约为1 023bp的VEEV E2基因胞外区,成功构建重组表达质粒pET-30a(+)-VEEV-E2,在37℃,0.6mmol/L IPTG诱导3h条件下目的蛋白表达量最高且主要以包涵体形式存在;将纯化的目的蛋白免疫BALB/C小鼠成功制备了抗VEEV E2蛋白胞外区鼠源多克隆抗体,经间接免疫荧光鉴定制备的抗体能够特异性识别真核表达的VEEV E2蛋白。VEEV E2基因胞外区在大肠杆菌中获得稳定表达,且表达的目的蛋白具有良好的免疫原性,为VEEV快速诊断方法及新型疫苗的研究奠定了基础。; 焦翠翠金宏丽蒋天琪曹增国曹增国吴芳芳李岭邱泊宁吴芳芳黄培王琪赵永坤冯娜迟航高玉伟黄培杨松涛夏咸柱; 关键词：委内瑞拉马脑炎病毒原核表达纯化多克隆抗体

裂谷热病毒eGn蛋白的制备及免疫原性验证: 2019年; 通过PCR扩增裂谷热病毒(RVFV) Gn蛋白胞外区(eGn)基因,连入原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒pET-30a(+)-RVFV-eGn。将重组质粒转化至感受态BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达,经HisTrapTMFF蛋白纯化柱纯化目的蛋白。将目的蛋白免疫BALB/c小鼠,分离小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,筛选分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,制备单克隆抗体,免疫荧光鉴定制备的单克隆抗体特性。结果显示,PCR扩增出1 287 bp的目的基因;构建的重组质粒转化BL21细胞后可有效表达目的蛋白,确定最佳表达条件为30℃,0.8 mmol/L IPTG诱导5 h,目的蛋白以包涵体形式表达;纯化后目的蛋白纯度为94.136%;制备的单克隆抗体可特异性识别哺乳动物细胞表达的Gn蛋白,表明RVFV eGn蛋白具有良好的免疫原性。研究结果为裂谷热新型疫苗和快速诊断试剂的研制奠定基础。; 韩秋雪黄培黄培金宏丽赵永坤焦翠翠张胜男徐胜男张颖曹增国张颖王化磊杨松涛夏咸柱; 关键词：单克隆抗体

克里米亚刚果出血热病毒抗体间接ELISA检测方法的建立被引量：2: 2021年; 目的原核表达并纯化克里米亚-刚果出血热病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus, CCHFV)M基因编码的包膜糖蛋白片段Gn1和Gc1,以两段目的蛋白为包被抗原分别建立检测CCHFV抗体的间接ELISA方法。方法 PCR扩增CCHFV M基因的抗原保守区胞外域Gn1和Gc1基因片段,分别克隆至pET-30a(+)载体,转化大肠埃希菌BL21(DE3),并对不同诱导条件(温度、IPTG浓度、时间)进行优化,使用His-Ni柱纯化目的蛋白,进行SDS-PAGE和Western blot鉴定,分别以纯化的Gn1和Gc1蛋白作为包被抗原建立抗体ELISA检测方法。结果表达并纯化了CCHFV糖蛋白片段Gn1、Gc1,分子质量分别为35 ku和23 ku;Western blot检测两种重组蛋白均能被抗Gn1,Gc1抗体识别。以纯化蛋白为抗原建立的间接ELISA方法检测已知阳性血清CCHFV抗体滴度为1∶10 240,检测RVFV、WNV、JEV感染者血清均阴性,变异系数<8%。结论表达纯化的Gn1和Gc1蛋白纯度均在90%以上,两种蛋白均表现出良好的免疫原性,以两种蛋白为包被抗原建立的抗体间接ELISA检测方法,该方法具有良好的特异性和敏感性。重组蛋白的制备为克里米亚刚果出血热疫苗免疫效果评价、疫病监测和新型疫苗研发奠定了基础。; 时智康王琪焦翠翠李武建黄培闫飞虎赵永坤冯娜马爱民马爱民夏咸柱; 关键词：原核表达抗体检测间接ELISA

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黄培

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