李玲玲
- 作品数：5 被引量：16H指数：3
- 供职机构：福州大学生物科学与工程学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金福建省自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学核科学技术农业科学更多>>
- 基质金属蛋白酶-2/9敏感型可跨膜融合抗氧化酶的表达、纯化和表征被引量：1
- 2022年
- 融合了跨膜肽的抗氧化酶可进入细胞,保护细胞免受放射损伤。然而跨膜肽的跨膜能力没有靶向性,其也可把抗氧化酶带入肿瘤细胞进而保护肿瘤细胞,降低放疗的效果。为此,根据多数肿瘤细胞微环境中存在活性基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2或MMP-9的特点,在细胞跨膜肽R9与人铜、锌超氧化物歧化酶(superoxide dismutase 1,SOD1)和谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)之间融合MMP-2/9的底物肽X,设计了融合蛋白GST-SOD1-X-R9。该蛋白在肿瘤微环境中可因MMP-2/9酶切底物肽X而失去跨膜肽,从而无法进入肿瘤细胞,进而只能进入正常细胞。全基因合成SOD1-X-R9序列,并将其插入原核表达载体pGEX-4T-1中,得到表达质粒,并实现了GST-SOD1-X-R9融合蛋白的可溶表达。GST-SOD1-X-R9经硫酸铵沉淀和GST亲和层析纯化,分子量约为47 kDa,与理论值一致。纯化的融合蛋白的SOD活性和GST活性分别为2954 U/mg和328 U/mg。GST-SOD1-X-R9的SOD活性或GST活性在生理条件下几乎没有变化。该融合蛋白在溶液中可被胶原酶Ⅳ部分水解。分别建立了2D和3D培养的HepG2细胞模型来检验肿瘤微环境中的MMP-2活力对该蛋白跨膜能力的影响。在2D培养模型中,HepG2的MMP-2活力极低,但在3D培养模型中,随着培养时间的增加,HepG2肿瘤球的体积变大,其胞外MMP-2活力也随之增强。GST-SOD1-X-R9在2D培养的HepG2细胞中具有和GST-SOD1-R9蛋白一样的跨膜效率,但在3D培养的HepG2细胞球中的跨膜能力大大降低。本研究为后续深入研究GST-SOD1-X-R9靶向防护正常细胞的氧化损伤效应奠定了基础。
- 何火聪林丽香李玲玲李玲玲林海英潘剑茹
- 关键词：抗氧化酶纯化
- 当归饮片蛋白质的提取与活性分析被引量：7
- 2016年
- 当归是传统的补血中药,其所含的多糖与小分子已有大量的研究,然而当归中的蛋白质组成与功效仍无人知晓。该研究通过0.05 mol·L^(-1)Tris-HCl(pH=8.0)缓冲液浸提和组织匀浆得到当归饮片粗提液,结合硫酸铵沉淀和透析法去除粗提液中的多糖及还原糖等小分子成分,得到当归饮片总蛋白质,并首次对其组成和生物活性进行了研究。结果表明:当归饮片蛋白含量较高,分子量为17.5~90.7 kDa,其中17.5 kDa的蛋白含量最高,达47%。饮片蛋白在pH 5~11范围内较为稳定,pH为3时,仅余少量17.5 kDa的蛋白。当归饮片蛋白质中至少有3种蛋白在80℃内稳定存在,其中热稳定性最好的是17.5 kDa的蛋白,在热处理温度达到100℃时,仍然稳定存在,但随着处理时间的延长,该蛋白有部分单体发生了交联反应。当归饮片蛋白质具有清除DPPH自由基的能力,且该能力随着热处理温度及热处理时间的增加而增加,pH处理会影响该能力,pH为5.0时,清除能力最高,5.0两侧清除能力均下降。此外,当归饮片蛋白质对细胞有很强的选择性,表现为对正常肝细胞L-02有显著的增殖作用(1.0~4.0 mg·m L^(-1),P<0.01),对白血病细胞K562则表现出显著的抑制作用(0.5~1.5 mg·mL^(-1),P<0.01),当归饮片蛋白浓度为1.0 mg·m L^(-1)时,可使L-02细胞增值率达550%(P<0.01),而K562细胞的抑制率达18.3%(P<0.01)。综上所述,当归饮片饮片蛋白具有重要的生物活性,可望从中开发出具有保肝作用的药物蛋白。
- 潘剑茹张小梅李玲玲王香玲吴伦巧陈莉娟李娴
- 关键词：当归饮片蛋白质稳定性DPPH自由基细胞增殖
- 当归生药中两种PR-10蛋白亚型的纯化与表征
- 2019年
- 为了进一步研究当归(Angelicasinensis)生药中的蛋白质及其功能,通过80%硫酸铵沉淀、Sephadex G-50凝胶过滤层析、DEAE-Sepharose阴离子交换层析,首次从当归生药中纯化出两种分子量相近的蛋白(命名为ASPR-C-1和ASPR-C-2)。ASPR-C-1和ASPR-C-2在SDS-PAGE上的分子量分别为17.33 kDa和17.18 kDa,在溶液中主要以单体形式存在,但会部分形成二聚体,二者均为糖蛋白,糖基含量分别为2.6%和8.2%。经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF?)鉴定发现ASPR-C-1和ASPR-C-2均为病程相关(Pathogenesis-related 10,PR-10)家族蛋白,且具有核糖核酸酶活性,比活分别为73.60 U/mg和146.76 U/mg。两种蛋白的最适pH相近,均为5.6左右,但最适温度不同,ASPR-C-1的为50℃,ASPR-C-2的为60℃。二者虽然在60℃下都表现出最大的酶活力稳定性,但在更高的处理温度(80–100℃)下,ASPR-C-1迅速失活,最终仅余20%左右活力,ASPR-C-2则表现出良好的热稳定性,最终仍有80%左右活力。此外,Fe^(2+)对二者的酶活性具有激活作用,而Ca^(2+)、Mg^(2+)、Zn^(2+)、Mn^(2+)、Ag^+、Cu^(2+)、EDTA、DTT和SDS则会不同程度地抑制二者的酶活性。研究结果为深入研究来自当归生药的PR-10蛋白的生物学功能奠定了基础。
- 王香玲李娴何火聪李玲玲吕迪陈翠煌叶小强刘树滔潘剑茹
- 关键词：糖蛋白纯化核糖核酸酶
- GST-SOD1-R9融合蛋白的表达、纯化、稳定性与跨膜效应被引量：4
- 2017年
- 穿膜肽TAT介导的双效抗氧化酶GST(谷胱甘肽巯基转移酶)-TAT-SOD1(Cu,Zn超氧化物歧化酶),可有效清除胞内自由基,其预防氧化损伤的效果强于SOD1-TAT,但前者的跨膜能力不如后者。为增强双效抗氧化酶的跨膜效率,本研究融合了SOD1和穿膜肽R9,合成SOD1-R9全基因序列,并将其插入带有GST的原核表达载体pGEX-4T-1中,成功构建了GST-SOD1-R9融合蛋白表达质粒。然后,将重组质粒pGEX-4T-1-SOD1-R9转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达融合蛋白,通过改变诱导温度和诱导时间,确定了融合蛋白在25℃下表达11 h,可得到高表达量的可溶性GST-SOD1-R9融合蛋白。利用80%硫酸铵沉淀和GST琼脂糖树脂纯化得到纯蛋白,应用SDS-PAGE和酶活性鉴定纯化的蛋白为正确表达的目标蛋白。GST-SOD1-R9融合蛋白的温度和pH稳定性实验结果证实,该蛋白在生理条件下具有良好的SOD和GST活性。细胞跨膜实验结果证明其跨膜能力与GST-TAT-SOD1融合蛋白相比显著增强(P<0.05)。这些工作为深入研究GST-SOD1-R9的抗氧化损伤效应建立了基础。
- 潘剑茹吴伦巧何火聪陈莉娟苏颖李玲玲刘树滔
- 关键词：融合蛋白表达纯化稳定性
- 当归蛋白对小鼠的辐射防护作用被引量：5
- 2018年
- 通过80%硫酸铵沉淀与Sephadex G-50凝胶过滤层析,从当归饮片中得到分子量为18.33 kDa的当归蛋白(命名AP)。用X射线对小鼠进行全身照射至吸收剂量6 Gy,建立急性照射损伤模型,以阿米福汀为对照,监测小鼠的体质量、外周血白细胞数、胸腺指数、脾脏指数、脾集落形成单位(CFU-S)、脾脏表观、脾组织病理分析和脾脏抗氧化活力等指标,检验当归蛋白AP的辐射防护效应。结果表明,当归蛋白AP可使受照小鼠的外周血白细胞数量、胸腺指数、脾脏指数、CFU-S和脾脏的过氧化氢酶活力分别增加135%、103%、23%、219%和180%,改善脾白髓损伤,使其体质量下降率减少94%。结果提示,当归蛋白AP对小鼠具有辐射防护作用。
- 李娴王香玲何火聪李玲玲陈翠煌潘剑茹
- 关键词：X射线辐射防护小鼠
