李兴志
- 作品数：7 被引量：13H指数：2
- 供职机构：黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金博士科研启动基金黑龙江省教育厅科学技术研究项目更多>>
- 相关领域：农业科学生物学医药卫生轻工技术与工程更多>>
- RIG-I蛋白2CARD结构域真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的表达定位被引量：2
- 2016年
- 目的构建RIG-I蛋白2CARD结构域真核表达载体及其在He La细胞中的表达定位。方法RIG-I是一种模式识别受体,它能够参与由MAVS介导的NF-κB天然抗病毒免疫反应。2CARD(Caspase activation and recruitment domain,CARD)结构域是视黄酸诱导基因-I(Retinoin acid inducible gene I,RIG-I)N端的2个串联重复的半胱天冬酶激活招募区,在病毒侵染细胞过程中,2CARD结构域发挥了识别并启动机体免疫应答的功能。本研究通过PCR获取2CARD片段酶切后,与p CMV-Myc载体连接后转染He La细胞,在He La细胞中表达,并应用Western Blot和免疫荧光进行鉴定。结果 2CARD基因在He La细胞中成功表达。结论本研究成功构建了p CMV-Myc-RIG-I-2CARD真核表达载体,通过将RIG-I分子中负责信号转导的2CARD在He La中表达,为研究病毒与RIG-I的互作关系奠定一定的基础。
- 张丽丽杨琦闫江翠张雅婷陈宁丁筠邹德华李兴志郑亮程丽鑫张华曹宏伟
- 关键词：RIG-I天然免疫质粒构建
- EV71病毒3C蛋白真核表达载体的构建及表达
- 2018年
- [目的]构建EV71病毒3C蛋白的真核表达载体,并验证其在细胞中的正确表达。[方法]采用RT-PCR技术,从EV71病毒基因组RNA中扩增3C基因,克隆到真核表达载体pc DNA3.0-Flag上,并转染He La细胞,通过Western blot和免疫荧光验证3C蛋白的表达。[结果]酶切及测序鉴定显示,EV71病毒3C真核表达载体构建成功。Western blot和免疫荧光结果证实3C蛋白在He La细胞中成功表达。[结论]该研究成功构建了真核表达载体pc DNA3.0-Flag-3C,为进一步研究EV71病毒3C蛋白生物学功能奠定了一定基础。
- 张华李兴志张雅婷张雅婷郑亮邹德华郑亮曹宏伟
- 关键词：EV71病毒基因克隆蛋白表达
- PEDV ORF3对IFN-β及ISGs转录水平的抑制效应被引量：1
- 2018年
- 探究PEDV ORF3蛋白对I型干扰素及其信号分子转录水平的影响。构建PEDV ORF3蛋白真核表达载体pcDNA3.0-FlagORF3,将重组载体以时间梯度和剂量梯度转染至293T细胞。通过RT-PCR检测ORF3对IFN-β、ISG54、ISG56转录水平的影响。结果显示,随着重组载体转染剂量的增加,IFN-βmRNA转录水平逐渐降低;将重组载体以时间梯度转染后,IFN-βmRNA转录水平在转染24 h后开始降低,ISG54、ISG56 mRNA转录水平在转染12 h后开始降低;并且PEDV ORF3蛋白明显抑制poly(I:C)诱导的IFN-βmRNA转录。以上结果表明PEDV ORF3蛋白可抑制IFN-β、ISG54、ISG56 mRNA转录,具有拮抗I型干扰素应答的功能。
- 程丽鑫姚丽莉邹德华郑亮李兴志张雅婷徐嘉欣武雪宁王显赫张华曹宏伟
- 关键词：PEDVORF3IFN-Β
- 猪流行性腹泻病毒E基因真核表达载体的构建及融合蛋白的表达被引量：7
- 2018年
- E蛋白是猪流行性腹泻病毒的小膜蛋白,为了研究E蛋白在病毒侵染宿主细胞过程中的作用,构建了PEDV E基因的真核表达载体。通过RT-PCR技术扩增E基因片段,经双酶切连接至pEGFP-N1载体,酶切鉴定及测序结果证实PEDV E基因成功克隆到pEGFP-N1中,并将重组质粒命名为pEGFP-N1-E。将pEGFP-N1-E转染He La,利用Western Blot和免疫荧光技术检测pEGFP-N1-E的表达以及定位情况,结果显示pEGFP-N1-E在He La细胞中成功表达,并且在胞质胞核均匀分布。结果表明:pEGFP-N1-E已被成功构建,并且在He La细胞中正确表达。为后续研究关于E基因的功能及其在抗病毒中所发挥的作用等方面奠定了研究基础。
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- 关键词：PEDVE基因蛋白表达
- EV71病毒诱导细胞应激颗粒形成的初步研究
- 2019年
- 肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)属于小RNA病毒科,肠道病毒属,肠道病毒A型的成员,是引起婴幼儿手足口病(Hand foot and mouth disease,HFMD)的一种重要病原病毒。但截至目前,EV71病毒与宿主细胞相互作用的机制仍不清楚。为了研究EV71病毒诱导应激颗粒形成的分子机制,研究首先构建了真核表达载体pDsRed2-G3BP1,随后构建了稳定表达融合蛋白RFP-G3BP1蛋白的HeLa细胞系(HeLaRFP-G3BP1),并应用Western Blot和免疫荧光技术证实了G3BP1融合蛋白的正确表达。EV71病毒感染HeLaRFP-G3BP1后,超过40%感染细胞的胞质中出现了应激颗粒。此外,应用微管特异性抑制剂破坏细胞微管完整性之后,显著抑制应激颗粒的迁移聚集。研究证明了EV71病毒诱导细胞应激颗粒的初步形成并且应激颗粒的迁移聚集依赖于微管的完整性。
- 武雪宁徐嘉欣王显赫邹德华郑亮郑亮李兴志张雅婷李兴志张华张雅婷
- 关键词：EV71病毒微管
- 猪流行性腹泻病毒黑龙江分离株ORF3基因的克隆、表达及分子进化分析被引量：3
- 2018年
- 克隆2017年黑龙江省大庆地区流行PEDV毒株(HLJ/DQ/2017)ORF3基因,通过真核表达及分子进化分析方法,为研究ORF3蛋白生物学功能提供重要的实验基础。TRIzol裂解法提取病毒RNA,RT-PCR技术扩增ORF3基因片段并测序,克隆至p EGFP-N1载体上,转染至HeLa细胞。应用DNAStar、DNAMAN、MEGA5.0软件进行序列比对和发育树绘制,应用Western Blot技术、Immunofluorescence技术检测ORF3蛋白的表达和细胞定位。经过酶切和测序验证p EGFP-N1载体中正确插入了ORF3基因,Western Blot法、Immunofluorescence法证实ORF3-EGFP融合蛋白聚集成核表达在HeLa细胞质的局部,由进化树分析显示,该毒株和2015年黑龙江地区流行的两个株毒株(HLJ/2015/116、HLJ/2015/DP1-1)位于同一群,但相比2011年黑龙江地区爆发的毒株(CH/HLJ/HH-2/2011),前者亲缘关系更近一些。融合蛋白ORF3-EGFP在HeLa细胞中聚集成核表达,遗传进化分析表明,该毒株与2015年黑龙江省流行的PEDV毒株相比无较大变异,且为目前世界最为流行的PEDV毒株类型。
- 邹德华郑亮程丽鑫李兴志张雅婷徐嘉欣武雪宁张华曹宏伟
- 关键词：PEDV进化分析
- 脂筏在柯萨奇病毒A组16型感染RD细胞中的作用
- 2019年
- 目的探究脂筏在柯萨奇病毒A组16型(CA16)感染RD细胞中的作用。方法使用胆固醇抑制剂甲基-β-环糊精(MβCD)驱散细胞膜胆固醇并破坏脂筏,分别采用RT-PCR和Western blot技术,在mRNA以及蛋白质水平检测MβCD处理对于CA16病毒感染RD细胞的影响。在RD细胞感染不同时间使用MβCD处理,并检测其对CA16病毒感染的影响。MβCD处理后,使用添加外源胆固醇的方式对细胞膜胆固醇进行补充,观察CA16病毒感染的变化。通过Western blot检测CA16感染后宿主细胞Akt磷酸化水平的变化,以及MβCD处理对宿主细胞Akt磷酸化的影响。结果 MβCD以剂量依赖方式抑制CA16病毒对RD细胞的感染,MβCD处理浓度为2.5、5、7.5、10 mmol/L时CA16 VP1的mRNA水平和蛋白质水平表达均出现降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。在感染前1 h使用MβCD处理CA16 VP1 mRNA和蛋白质水平的表达分别降低了(84.23±3.70)%和(81.80±5.09)%,与未做处理的对照组相比具有统计学意义(P<0.05)。在MβCD处理后添加200、300、400μg/ml的外源胆固醇,VP1 mRNA水平的表达恢复了(26.63±7.69)%、(77.06±6.91)%、(91.36±12.09)%,VP1蛋白质水平的表达恢复了(28.71±8.27)%、(51.14±5.82)%、(58.14±7.35)%,且VP1表达与MβCD单独处理相比差异均具有统计学意义(P<0.05)。CA16感染30 min时pAkt表达上升了(91.86±27.14)%,差异具有统计学意义(P<0.05)。CA16感染MβCD预处理过的细胞pAkt未发生显著变化(P>0.05)。结论脂筏在CA16病毒感染RD细胞与激活PI3K/Akt通路中起重要作用。
- 李兴志李鹏飞刘昕旸程丽鑫郑亮张雅婷沈玉江武雪宁徐嘉欣王显赫张华曹宏伟
- 关键词：柯萨奇病毒A组16型脂筏胆固醇
