刘亚
- 作品数：3 被引量：5H指数：1
- 供职机构：重庆医科大学检验医学院感染性疾病分子生物学教育部重点实验室更多>>
- 发文基金：重庆市教育委员会科学技术研究项目国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 通过自诱导方法对乙型肝炎病毒聚合酶TP区进行可溶性表达及鉴定被引量：5
- 2017年
- 目的构建包含乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)聚合酶TP区段的重组原核表达质粒,转化表达型大肠埃希菌,以自诱导培养方法获得可溶性表达,并对其进行鉴定。方法分析HBV(A型)聚合酶N-末端1-192 AA区域的DNA序列,通过网络工具(http://www.jcat.de/)在线优化,并在5′和3′端分别添加NdeⅠ和XhoⅠ限制性内切酶位点后,送英潍捷基(上海)贸易有限公司进行人工合成;将人工合成的TP-DNA双酶切后,插入pET32a(+)原核表达载体,构建重组原核表达质粒,转化大肠埃希菌BL21(DE3)pLysS进行自诱导表达。结果重组原核表达质粒pET32a(+)/POL-TP-Opt经双酶切及测序证明构建正确;在表达菌的破菌上清中有特异性表达的蛋白,相对分子质量约20 000,经SDS-PAGE和Western blot鉴定,为可溶性的重组TP蛋白。结论通过自诱导培养方法,直接成功获得可溶性的重组TP蛋白,改变了长期以来依靠包涵体复性对TP蛋白相关功能进行研究的状况。
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- 关键词：乙型肝炎病毒聚合酶原核细胞基因表达
- 一种构建HBV聚合酶特定位点多种突变的方法被引量：1
- 2017年
- 核苷(酸)类似物[neocleot(s)ide analogues,NUCs]在治疗乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染的过程中常见的一个问题就是耐药的产生。耐药的产生与HBV逆转录酶(reverse transcriptase,RT)区特定位点突变具有直接关系。现有的体外表型分析方法存在固有的限制。本文提出一种构建HBV聚合酶特定位点多种突变的新方法,即位点特异性随机突变,通过一轮聚合酶链式反应扩增,在RT区特定位点引入多种突变形式,再结合golden-gate克隆法以及片段替换反应(fragment substitution reaction,FSR)将包含不同突变的DNA片段克隆到相应载体中以进行下一步分析。通过这种方法,构建了阿德福韦(adefovir,ADV)耐药位点rt181和rt236位点的多种突变形式。
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- 关键词：克隆核苷类似物耐药
- 一种适用于片段替换/插入突变扫描的克隆方法
- 2016年
- 功能序列的改造是基因工程的一项基础技术。序列改造往往涉及较大片段的插入或替换,为了获得更优化的改造序列,这种片段插入或替换经常需要以扫描方式进行。传统的酶切连接方式在这种情况下可能难以实现或者费时费力。建立了一种golden gate方法结合混合克隆和快速鉴定的策略(简称Gmix),利用该策略,成功地将外源基因(Gaussia荧光素酶基因)以4种模式,扫描式插入或替换HBV复制质粒的指定区域。该方法成功率高,操作简便快速且成本较低,适合于其他DNA序列的类似改造工作。
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- 关键词：克隆基因工程GOLDENGATE
