李孝良
- 作品数：8 被引量：10H指数：2
- 供职机构：江苏科技大学生物与环境工程学院更多>>
- 发文基金：国家现代农业产业技术体系建设项目国家自然科学基金更多>>
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- 应用荧光染色剂Fluorescent Brightener 28和Propidium Iodide染色识别家蚕微孢子虫被引量：5
- 2017年
- 家蚕微粒子病被列为蚕种生产的唯一法定检疫对象,母蛾镜检家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)是主要的检疫方法,但其准确性受到多种因素影响。为探究应用荧光增白剂28(Fluorescent Brightener 28,FB28)和碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)染色识别Nb孢子的可行性,以感染Nb的家蚕幼虫中肠、蚕卵、母蛾、蚁蚕为材料,联合应用以上2种荧光染色剂进行Nb孢子检测效果试验。在荧光显微镜下可见成熟的Nb孢子被FB28染成蓝色且细胞核被PI染成红色,而未成熟的孢子只能被PI染色。采用2种荧光染色剂染色,在被感染的幼虫中肠、蚕卵、母蛾、蚁蚕中都能够检测到Nb孢子,并且带毒母蛾研磨液样品稀释1 000倍依然可以检测到Nb孢子。幼虫中肠感染后1~2 d很难观察到Nb孢子,感染后3 d可以观察到局部存在少量未成熟的Nb,感染后4 d开始局部出现成熟的Nb,至感染后5~6 d可见组织中大面积分布有成熟孢子和未成熟孢子。荧光显微镜下观察被染色的Nb孢子的细胞核明显小于幼虫中肠细胞核,且亮度明显较强,卵壳、母蛾、蚁蚕表面的几丁质碎片形状与Nb孢子明显不同,并且不能被PI染色。试验结果表明,该染色检测方法可以排除蚕体组织细胞、几丁质碎片的干扰,提高对Nb检测的准确度,并且在Nb浓度较低的情况下,可以提高检测的灵敏度。
- 戴卫江陈功彭祥然李孝良马琳唐旭东徐莉沈中元
- 关键词：家蚕微孢子虫检疫方法碘化丙啶荧光染色
- 家蚕微孢子虫海藻糖合成酶基因Nbtps1的克隆与原核表达
- 2017年
- 海藻糖在保护细胞质膜和生物大分子空间结构,维持胞内渗透压增大的过程中发挥重要作用,海藻糖合成酶是海藻糖合成途径中的一个关键酶。通过检索微孢子虫基因组数据库发现,家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)基因组中含有4个海藻糖合成酶基因,其中Nbtps1基因的开放阅读框长1 386 bp,为单外显子结构,编码461个氨基酸残基,预测蛋白质分子质量53.7 k D,等电点5.19。Nb TPS1蛋白序列含有1个糖基转移酶结构域和4个潜在的N-糖基化位点,亚细胞定位预测该蛋白质位于细胞质中。多重序列比对分析结果表明,Nb TPS1与东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)、兔脑炎微孢子虫(Encephalitozoon cuniculi)海藻糖合成酶的氨基酸序列相似度分别为59.0%、54.7%,系统发育进化树显示三者的亲缘关系与之相符。构建重组表达载体Nbtps1/p ET-28a(+)并转化大肠埃希菌Rosetta(DE3)菌株,经IPTG诱导表达及亲和纯化后获得最终质量浓度为1.18 mg/m L的重组融合蛋白His-Nb TPS1。用纯化后的融合蛋白制备兔多克隆抗体Anti-Nb TPS1,利用间接ELISA法测定多克隆抗体的效价达1∶25 600,并通过Western blotting检测验证了该多克隆抗体的特异性,为研究Nb TPS1的生物学功能以及家蚕微孢子虫的间接免疫检测奠定了实验基础。
- 朱峰李孝良唐旭东徐莉白兴荣沈中元
- 关键词：家蚕微孢子虫海藻糖合成酶原核表达多克隆抗体
- 家蚕微孢子虫己糖激酶基因的克隆及序列结构分析和原核表达被引量：1
- 2018年
- 己糖激酶（hexokinase,HXK）是糖酵解途径的限速酶,在能量代谢中充当极其重要的角色。家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）具有完整的糖酵解途径,其基因组中有2个序列相似度较高的己糖激酶编码基因拷贝（NBO_1320g0001,NBO_27g0008）。根据其中的一个基因拷贝（NBO_27g0008）序列设计特异性引物,以家蚕微孢子虫基因组DNA为模板成功克隆了该基因,命名为Nb HXK-1。该基因大小为894 bp,包含完整的ORF,编码297个氨基酸,预测蛋白质的分子质量为34.241 k D,等电点（p I）为5.26,蛋白质的氨基酸序列有31个磷酸化位点和4个潜在的N-糖基化位点,无跨膜结构域,有信号肽,二级结构主要由α螺旋（54.55%）、延伸片段（17.80%）和无规则卷曲（27.61%）组成。系统进化分析显示Nb HXK-1与东方蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae）己糖激酶（Nc HXK）氨基酸序列的亲缘关系较近。将Nb HXK-1基因插入原核表达载体p ET-28a（＋）并转化BL21（DE3）感受态细胞,用IPTG诱导表达后经蛋白质串联质谱鉴定和Western blot分析显示,获得了与预期大小一致的约35 k D的重组Nb HXK-1蛋白,为进一步阐明Nb HXK-1的生物学功能奠定了基础。
- 陈红丽彭祥然李孝良Bismark Kyei尚瑞沙齐静茹张轶岭徐莉沈中元
- 关键词：家蚕微孢子虫己糖激酶基因克隆原核表达
- 家蚕微孢子虫假定层粘连蛋白基因NbHLAMB4的克隆和序列分析及互作蛋白质筛选
- 2016年
- 层粘连蛋白是重要的细胞外基质成分之一,在基膜的构建及细胞的黏附等方面都有重要作用。通过检索微孢子虫数据库发现家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)存在假定层粘连蛋白基因Nb HLAMB4,根据该基因序列设计引物,以家蚕微孢子虫基因组DNA为模板克隆了Nb HLAMB4基因。该基因的开放阅读框(ORF)全长为1 104 bp,预测编码的蛋白质含有367个氨基酸,分子质量为43.74 k D,等电点为5.72。Nb HLAMB4蛋白序列含有一个N-糖基化位点和Pfam:SAS-6_N结构域,无信号肽,也无跨膜结构域。应用酵母双杂交技术,以Nb HLAMB4作为诱饵蛋白,通过筛选家蚕中肠c DNA文库,初步得到3个与Nb HLAMB4互作的候选蛋白质,分别是家蚕热休克蛋白(Hsp40)、锌指蛋白420类似物(similar to zinc finger protein 420)、氨肽酶N(aminopeptidase N)。研究结果为阐明家蚕微孢子虫的侵染机制提供了新的线索。
- 李楠戴卫江李孝良彭祥然唐旭东徐莉沈中元
- 关键词：家蚕微孢子虫基因克隆酵母双杂交技术
- 家蚕微孢子虫水通道蛋白基因NbAQP的克隆及表达特征分析被引量：1
- 2016年
- 水通道蛋白(aquaporin,AQP)是在动物、植物、微生物细胞膜上发现的能够高选择性透过水分的一类通道蛋白。通过克隆家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)的AQP基因,并分析其表达特征,为研究AQP在Nb孢子侵染宿主细胞时调节孢子内渗透压的作用积累基础信息。依据从Microsporidia DB和MIPModDB数据库比对获得的序列设计引物,以家蚕微孢子虫基因组DNA为模板克隆了NbAQP基因,该基因大小为750 bp,编码蛋白质分子质量为26.66 k D,具有MIP超家族水通道蛋白的保守跨膜结构域。用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR的方法,在Nb孢子感染宿主家蚕的7 d内,家蚕中肠组织中都能检测到NbAQP基因的表达,自感染后2 d开始,NbAQP基因的表达水平开始明显上升,直至感染后7 d达到最高水平。NbAQP基因的高水平表达时相与家蚕添食Nb孢子后中肠组织中成熟Nb孢子大量出现的时间相一致,初步推测NbAQP可能在家蚕微孢子虫成熟孢子发芽时的孢子内渗透压调节中起到重要作用。
- 王玮陈功彭祥然李孝良唐旭东徐莉沈中元
- 关键词：家蚕微孢子虫水通道蛋白基因克隆实时荧光定量PCR
- 家蚕微孢子虫海藻糖酶(Trehalase)基因的生物信息学分析及原核表达和多克隆抗体制备被引量：2
- 2016年
- 海藻糖是家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)成熟孢子的主要糖类物质之一,海藻糖酶作为海藻糖代谢的主要催化酶,在微孢子虫的发芽及侵染过程中发挥重要作用。通过生物信息学分析发现,家蚕微孢子虫的海藻糖酶具有4个序列相似度较高的编码基因拷贝(Nb Tre1、Nb Tre2、Nb Tre3和Nb Tre4),除了Nb Tre4编码蛋白质的N端有18个氨基酸组成的信号肽,其他拷贝的编码蛋白质均没有信号肽结构域,但都具有少数的N-糖基化位点,而没有O-糖基化位点,此外,丝氨酸磷酸化位点的比率也较高,二级结构较为简单,仅有螺旋区和低复杂度区。基于生物信息学分析结果,设计特异性引物克隆了Nb Tre1基因,该基因片段长933 bp,编码310个氨基酸,预测蛋白质分子质量36.7 k D,蛋白质的氨基酸序列有2个潜在的N-糖基化位点和14个磷酸化位点。通过构建重组表达载体并转化Escherichia coli Rosetta(DE3)感受态细胞,获得Nb Tre1蛋白的表达菌株,利用IPTG诱导获得大量以包涵体形式表达的融合Nb Tre1蛋白,其分子质量与预期值一致。融合Nb Tre1蛋白经亲和层析纯化后免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,利用间接ELISA法测定多克隆抗体的效价达1∶25 600。通过Western blot检测验证了该多克隆抗体的特异性,制备的多克隆抗体能够应用于家蚕微孢子虫海藻糖酶的检测等。
- 李孝良彭祥然陈功戴卫江唐旭东徐莉沈中元
- 关键词：家蚕微孢子虫海藻糖酶原核表达多克隆抗体
- 家蚕微孢子虫烯醇化酶(Enolase)基因的克隆及序列分析与原核表达被引量：2
- 2016年
- 烯醇化酶(enolase,ENO)是糖酵解途径的限速酶,对家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)烯醇化酶的研究有助于了解微孢子虫的能量代谢机制。依据微孢子虫基因组数据库中的家蚕微孢子虫烯醇化酶编码序列设计引物,以家蚕微孢子虫基因组DNA为模板,PCR扩增获得家蚕微孢子虫烯醇化酶基因(Nb ENO)。该基因ORF全长1 242 bp,编码413个氨基酸,预测蛋白质分子质量46.323 k D,等电点6.13;蛋白质二级结构主要由α螺旋(28.33%)、延伸片段(22.52%)和无规则卷曲(49.15%)组成,含有25个磷酸化位点和1个糖基化位点,无信号肽和跨膜结构域。系统进化树分析Nb ENO与蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)烯醇化酶基因序列(Nc ENO)的亲缘关系较近,序列比对显示二者的一致性为62.10%。将Nb ENO基因插入原核表达载体p ET-28a并转化大肠埃希菌Rosatta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后获得预期大小约50 k D的重组Nb ENO蛋白,有利于进一步研究Nb ENO的功能及亚细胞定位。
- 彭祥然李孝良陈功戴卫江李楠王玮唐旭东徐莉沈中元
- 关键词：家蚕微孢子虫烯醇化酶基因克隆原核表达
- 家蚕微孢子虫感染BmN细胞的蛋白质组学及其海藻糖酶的研究
- 微孢子虫是一类专营细胞内寄生的单细胞真核生物，具有广泛的宿主域。家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）引起的家蚕微粒子病是蚕桑业中的重要病害之一，给蚕业生产带来重大损失。近年来，宿主与病原体之间相互作用的研究已成...
- 李孝良
- 关键词：家蚕水通道蛋白海藻糖酶多克隆抗体
- 文献传递
