杨江涛
- 作品数：1 被引量：6H指数：1
- 供职机构：廊坊师范学院生命科学学院遗传与育种研究所更多>>
- 发文基金：河北省自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学农业科学更多>>
- 棉花精氨琥珀酸合成酶基因GhASS1的克隆及表达分析被引量：6
- 2016年
- 【目的】克隆棉花精氨琥珀酸合成酶基因Gh ASS1的c DNA序列,并利用原核表达系统高效表达融合蛋白,检测融合蛋白的精氨琥珀酸合成酶活性及其表达对工程菌生长、耐盐能力及与游离L-瓜氨酸(L-Cit)和L-精氨酸(L-Arg)含量的影响,为解析该基因的功能及作用机制奠定基础。【方法】以拟南芥推断的精氨琥珀酸合成酶c DNA序列作为探针,利用电子克隆和RT-PCR技术,从棉花幼叶中获得c DNA片段,T/A克隆测序后得其序列信息,利用生物信息学软件分析其DNA结构、蛋白质结构、功能域和同源性,并构建系统进化树。利用q RT-PCR检测其在盐胁迫下的表达模式;将Gh ASS1的开放阅读框连接到原核表达载体p Cold-TF上,构建融合表达载体p Cold-Gh ASS1,转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)plys S中进行IPTG诱导表达,利用SDS-PAGE法测定表达产物分子量,焦磷酸荧光法测定酶活性和比活力,HPLC法测定工程菌中L-Cit和L-Arg的含量,对比不同温度和不同Na Cl浓度下工程菌与对照菌的生长速度及其体内L-Cit、L-Arg含量及L-Arg/L-Cit。【结果】棉花Gh ASS1存在于D基因组的第1染色体上,由10个外显子和9个内含子构成,其c DNA全长序列共1 584 bp,其中5′非翻译区22 bp,开放阅读框1 485 bp,3′端非翻译区77 bp,编码产物由494个氨基酸组成,推断分子量为54 k D,等电点6.74;序列比对分析表明Gh ASS1与大肠杆菌、酵母和拟南芥中同源蛋白序列一致性分别为21.81%、41.1%和78.5%,且具有典型的精氨琥珀酸合成酶结构模序;系统进化分析显示Gh ASS1与番茄、马铃薯和烟草中同源蛋白亲缘关系最近,而与云杉、卷柏中同源蛋白亲缘关系最远;盐胁迫可上调叶片中Gh ASS1的表达,1 d时达到峰值,随后逐渐下降,推测Gh ASS1参与棉花对盐胁迫的早期响应。表达载体p Cold-Gh ASS1在工程菌中表达的融合蛋白分子量约108 k D,与预期相符,在体外具有精氨琥珀酸合成酶活性;与
- 王慧飞孙艳香冯雪张一名杨江涛马梅芳陈光
- 关键词：棉花REAL-TIMEPCR
