严会文
- 作品数：5 被引量：10H指数：2
- 供职机构：贵州医科大学更多>>
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- 相关领域：医药卫生更多>>
- β-神经生长因子基因克隆和诱导表达及其对PC12细胞的诱导分化作用被引量：5
- 2016年
- 目的构建β-神经生长因子(β-NGF)慢病毒表达载体p LVX-TRE3G-IRES-β-NGF,应用Tet-on 3G四环素诱导表达系统,探讨β-NGF在人胚肾(HEK293FT)细胞中的过表达情况,及其对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12)细胞分化的影响。方法从SD大鼠脑组织提取总RNA,反转录成c DNA,利用分子生物学技术,克隆鼠β-NGF基因完整编码区,将β-NGF基因定向插入载体p LVX-TRE3G-IRES中。将重组载体p LVX-TRE3G-IRES-β-NGF和载体p LVX-Tet3G分别转染空白HEK293FT细胞,制备收获慢病毒,共转染HEK293FT细胞,同时用不同剂量强力霉素(Dox)诱导NGF表达(分为未转染组、0、100、500和1000μg/L Dox诱导表达组)。48h后收集细胞,免疫印迹法(Western blotting)检测各组细胞内β-NGF表达情况。同时收集培养上清,1.ELISA检测各组上清内β-NGF的分泌量;2.制作条件培养基,加入PC12细胞培养基中进行诱导培养,观察PC12细胞诱导分化情况。结果双酶切和测序鉴定重组质粒p LVX-TRE3G-IRES-β-NGF序列和方向正确;β-NGF在转染细胞内被诱导表达,随着Dox剂量增加,表达量增强;β-NGF在培养基的上清内表达,表达量随Dox剂量增加而增多。诱导表达的条件培养基可诱导PC12细胞形态改变,表达神经元特异性烯醇化酶(NSE)蛋白。结论成功重组慢病毒载体p LVX-TRE3G-IRES-β-NGF,转染后β-NGF基因能够在HEK293FT细胞中表达和分泌,且该蛋白具有诱导PC12细胞向神经元样细胞分化的能力;运用Tet-On 3G四环素诱导表达系统,可成功诱导表达获得不同剂量β-NGF蛋白。
- 高杰严会文李红黄悦胡蓉苏敏
- 关键词：Β-神经生长因子PC12细胞强力霉素酶联免疫吸附法免疫印迹法
- 眼发育关键基因PAX6真核表达载体构建以及PAX6/mESCs细胞系的建立
- 目的：构建眼发育关键基因PAX6的真核表达载体，初步探究其在真核细胞的表达，进而将PAX6基因转染入小鼠（m）ESCs并获得PAX6/mESCs稳株，为进一步探讨利用PAX6诱导ESCs定向分化为LSCs的可能性奠定基础...
- 严会文
- 关键词：眼发育PAX6基因真核表达载体脂质体转染定向分化
- 大鼠PAX6基因真核表达载体构建和表达以及PAX6/mESC细胞系的建立
- 严会文苏敏黄悦胡蓉李红高杰廖文萍闫丽丽
- 大鼠角膜缘干细胞分离培养及其横向分化能力初探被引量：4
- 2016年
- 目的体外分离培养大鼠角膜缘干细胞(LSCs),并探讨在细胞因子EGF、b FGF联合RA作用下,LSCs体外横向分化为神经干细胞样细胞的能力。方法体外分离培养LSCs并进行p63免疫组化鉴定。在原代培养的LSCs中,设立2个诱导组进行分化实验,诱导组1加入EGF(20 ng/mL)和b FGF(10 ng/mL),诱导组2加入EGF(20 ng/mL)、b FGF(10 ng/mL)和RA(25 ng/mL),同时设立空白对照组。培养7 d后,收集各组细胞作神经元标志物Nestin的免疫组化检测及阳性细胞计数,收集各组细胞蛋白做蛋白免疫印迹分析各组Nestin蛋白表达情况,相关数据作统计学分析。结果免疫组化结果显示,体外分离培养的LSCs p63呈阳性,诱导分化的2组细胞Nestin呈阳性表达,阳性率分别为(77.01±6.32)%和(84.01±5.43)%,诱导组2的诱导率高于诱导组1,差异具有统计学意义(P<0.05);对照组细胞Nestin呈阴性表达。蛋白免疫印迹结果显示,2个诱导组在240 k Da处可见Nestin蛋白条带,诱导组2 Nestin蛋白表达略高于诱导组1,对照组未见Nestin蛋白条带。结论成功分离培养大鼠LSCs,在细胞因子EGF、b FGF作用下,LSCs具有横向分化为神经干细胞样细胞的能力,同时联合使用RA有促进LSCs向神经干细胞样细胞分化的作用。
- 严会文陈剑英高杰廖文萍苏敏胡蓉
- 关键词：表皮生长因子碱性成纤维细胞生长因子全反式维甲酸
- 大鼠PAX6基因真核表达载体构建及鉴定被引量：2
- 2016年
- 目的:构建携带绿色荧光蛋白(GFP)报告基因及PAX6基因的重组真核表达载体,观察其在人胚肾细胞(293FT)细胞中的表达。方法:采用聚合酶链式反应(PCR)从大鼠脑组织中获取PAX6基因,经连接T载体测序验证正确后,与真核表达载体p EF1α-IRES-Ac GFP经Sal I/Bam HI双酶切后;经T4 DNA连接酶连接,获得重组质粒p EF1α-PAX6-IRES-Ac GFP,用菌液PCR、Sal I/Bam HI双酶切及测序鉴定正确后,用脂质体法转染293FT细胞,采用倒置荧光显微镜观察GFP的表达、蛋白印迹(Western blot)法检测PAX6蛋白表达。结果:重组质粒p EF1α-PAX6-IRES-Ac GFP经RT-PCR和双酶切均得到大小为1 269 bp的目的条带,测序鉴定该序列与Gen Bank中大鼠PAX6基因序列的同源性达100%,插入基因的大小和方向正确;重组质粒转染293FT细胞后可见GFP绿色荧光,Western blot显示PAX6蛋白表达。结论:成功构建了PAX6真核表达重组质粒p EF1α-PAX6-IRES-Ac GFP,能在293FT细胞中表达PAX6蛋白。
- 严会文苏敏高杰廖文萍闫丽丽黄悦
- 关键词：绿色荧光蛋白PAX6基因脂质体转染
