梁云华
- 作品数：1 被引量：1H指数：1
- 供职机构：成都军区昆明总医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 慢病毒介导shRNA沉默E2-2基因促进内皮前体细胞增殖被引量：1
- 2015年
- 目的构建小鼠转录因子基因E2-2 RNA干扰（RNA interference,RNAi）慢病毒载体,并观测其沉默E2-2基因对内皮前体细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）增殖的影响。方法 SPF级昆明小鼠20只,雌雄不拘,4周龄,体质量18-20 g。分离、培养小鼠骨髓EPCs,并予以鉴定。针对E2-2基因mRNA序列,筛选3个siRNA干扰靶点并予以合成;将合成的siRNA导入EPCs,用RT-PCR法检测其对靶基因的抑制效果,以确定最佳siRNA。设计并合成针对最佳siRNA靶序列的shRNA,连入FT203-PLVX载体,构建慢病毒载体FT203-PLVX/E2-2shRNA,并予以测序鉴定。测序正确者经293细胞包装,形成具高效感染力的FT203-PLVX/E2-2shRNA慢病毒。将该重组慢病毒感染EPCs,倒置显微镜观测被感染细胞的绿色荧光蛋白（GFP）的表达变化、CCK-8法检测被感染细胞的增殖情况;在mRNA和蛋白水平分别检测并定量分析被感染细胞的E2-2及核抗原PCNA基因及其编码蛋白的表达变化。结果小鼠骨髓EPCs得以分离、培养与鉴定。筛检到E2-2基因的最佳干扰靶序列为CGTCAGCTAGTGTTTCTAA;测序证实,成功构建FT203-PLVX/E2-2 shRNA慢病毒载体。荧光观察显示,被慢病毒感染的EPCs明显表达GFP。CCK-8检测表明,与对照细胞比较,沉默E2-2的EPCs的增殖加快,48 h开始变得更为明显（P〈0.01）;mRNA和蛋白水平检测及定量分析结果显示,E2-2 shRNA慢病毒能有效沉默EPCs的E2-2,并上调其核抗原PCNA基因及其编码蛋白的表达。结论小鼠骨髓EPCs得以分离、培养与鉴定;成功构建E2-2基因RNAi慢病毒载体,该载体能有效沉默EPCs的E2-2基因,促使EPCs的增殖并上调其核抗原PCNA的表达。
- 刘晓丽马阳梁源喻杨梁云华王红
- 关键词：RNAI内皮前体细胞慢病毒
