宋永利
- 作品数：10 被引量：25H指数：3
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- 牛朊蛋白基因prnp敲除载体的构建及真核细胞转染被引量：3
- 2010年
- 利用正负筛选策略(Positive-negative selection,PNS)对中靶细胞进行富集是提高体细胞基因打靶效率常用的策略之一。将动物的朊蛋白基因prnp敲除,使其不能表达朊蛋白(传染性海绵状脑病的致病蛋白),从而使其具有抵抗Prion病感染的能力。本研究采用正负筛选策略,构建了牛prnp基因的双等位基因敲除载体,经内切酶Sac Ⅱ线性化后,再通过电穿孔转染牛胎儿成纤维细胞,分别用600μg/mL G418、200nmol/mL Ganciclovir(GCV)进行正负药物筛选,最终获得了176个药物抗性细胞克隆,进一步采用PCR、测序、间接免疫荧光试验及Western blotting试验对细胞克隆进行鉴定,结果表明,其中的9个细胞克隆为中靶细胞,证明牛prnp基因被成功敲除。本研究为牛prnp的敲除提供了可行性依据,并为体细胞核移植生产敲除朊蛋白基因的转基因动物提供供体细胞。
- 张海林程胖兰杰宋永利张涌
- 关键词：基因打靶朊蛋白牛胎儿成纤维细胞PRNP间接免疫荧光BLOTTING
- 牛胎儿皮肤成纤维细胞的分离培养及转染Ipr1基因被引量：2
- 2011年
- 为了为核移植提供供体细胞,本研究构建了真核表达载体PEGFP-SRA-Ipr1,并研究了牛胎儿皮肤成纤维细胞的体外分离培养,进行了Ipr1基因转染。克隆Ipr1基因和SR-A启动子,并构建了巨噬细胞特异性真核表达载体。用组织块贴壁法分离培养牛胎儿皮肤成纤维细胞,在体外经传代、纯化后,用电穿孔法将真核表达载体PEGFP-SRA-Ipr1转染至经体外纯化的第4～10代牛胎儿成纤维细胞,24h后观察荧光表达,48h后加入600μg.mL-1 G418,筛选1周,300μg.mL-1持续筛选,然后挑选单克隆,继续扩大培养。对稳定转染的牛胎儿成纤维细胞进行PCR检测和核型分析。结果,转染24h后有绿色荧光蛋白表达,并经G418筛选获得稳定转染PEG-FP-SRA-Ipr1的牛胎儿成纤维细胞株,经PCR检测在大约1 500bp处有目的片段,经流式细胞仪分析转染细胞染色体倍型未发生变化,仍是二倍体。说明目的基因已经成功整合,同时保持了遗传稳定性。可以作为核移植进行转基因克隆牛研究。
- 宋永利何小宁华松兰杰郑月茂贺小英李吉霞权富生张涌
- 关键词：供体细胞真核表达载体牛胎儿成纤维细胞电穿孔绿色荧光蛋白
- 一种牛体细胞克隆胚胎培养液及其培养方法
- 一种牛体细胞克隆胚胎培养液及其培养方法，该培养液包括市售牛体细胞克隆胚胎输卵管培养液(mSOF)，还包括激活素A，该激活素A的浓度是20～80ng/mL；其培养方法是用常规条件培养牛体细胞颗粒细胞单层3天，从第4天开始，...
- 华松张涌兰杰刘永刚宋永利王勇胜刘军
- 文献传递
- 同源重组技术在转基因动物抗病育种中的应用被引量：1
- 2011年
- 1抗病育种的概述转基因就是将目的基因导入受体细胞的过程。由于这一技术能够实现基因的种间转移,用于动物育种将大大提高育种的目的性而加快育种进程。
- 宋永利华松何小宁兰杰刘永刚张涌
- 关键词：转基因动物抗病育种转基因技术同源重组
- 一种包含Ipr1巨噬细胞异性表达载体的牛胎儿成纤维细胞
- 本发明公开了一种包含Ipr1巨噬细胞异性表达载体的牛胎儿成纤维细胞，构建了一种包含Ipr1巨噬细胞异性表达载体Psp-EGFP-Ipr1，以及基于该载体的包含包含Ipr1巨噬细胞异性表达载体的牛胎儿成纤维细胞系，利用该细...
- 宋永利张涌华松何小宁兰杰王勇胜刘军贺小英
- 文献传递
- 体细胞克隆牛产品安全分析被引量：2
- 2010年
- 体细胞克隆技术是将已分化的体细胞移到去核的成熟卵母细胞中,通过体外激活和培养,再移植入受体母畜子宫内,繁殖出具有相同基因型后代的一种技术。该技术可以大幅提升繁殖效率,并提供高质、充足和营养丰富的动物食品。近年来,美国、日本和欧洲等国家相继宣布体细胞克隆动物食品可以上市。然而,目前体细胞克隆效率相当低下,即使是出生的克隆动物也往往伴随发育畸形或高死亡率等现象,在对克隆动物发育异常知之甚少的情况下,宣布克隆动物产品上市是否为时过早?以下综述了克隆牛肉、奶及其产品安全。
- 华松兰杰宋永利鲁成龙张涌
- 关键词：食品安全体细胞克隆
- 基因打靶定点突变秦川牛MSTN基因被引量：9
- 2010年
- Myostatin(MSTN,肌肉生长抑制素)基因属于TGF-β超家族,对骨骼肌的生长发育具有负调控作用。该基因的功能缺失,能够引起肉用动物的"双肌"表型,从而提高产肉率。基因打靶技术是制作转基因动物的常用方法。构建了两个置换型打靶载体pA2T-Mstn4.0和pA2T-Mstn3.2,通过同源重组将G938A突变点引入秦川牛MSTN基因第三外显子。电穿孔方法转染秦川牛胎儿成纤维细胞,经过600μg/mL G418和50nmol/L GCV的药物正负筛选,共得到170个药物抗性细胞克隆。对细胞克隆进行PCR、测序及Southern blotting鉴定,结果显示,第58号细胞克隆为发生了正确同源重组的中靶细胞。牛胎儿成纤维细胞中的MSTN基因的一条等位基因被成功改造。
- 刘永刚华松兰杰宋永利何玉龙权富生张涌
- 关键词：肌肉生长抑制素基因打靶定点突变成纤维细胞
- 巨噬细胞RAW264.7的培养及电转染条件的优化被引量：8
- 2010年
- 为了建立最优的巨噬细胞RAW264.7培养方法和电转染条件,在细胞培养时采用两种方法了解细胞的培养特性并进行电转染条件的优化,建立并验证RAW264.7细胞快速、无血清培养体系的电转染方法。以绿色荧光蛋白（GFP）为报告基因,进一步优化巨噬细胞电穿孔的条件。通过控制电压（250~420 V）、脉冲时间、电击次数、温度、电击缓冲液等转染条件,采用不同的条件组合,用电穿孔法将质粒pEGFP-C1转染于培养的RAW 264.7细胞。通过荧光显微镜分析转染效率,可见：用胰酶和细胞刮刀消化RAW264.7细胞,细胞损伤小,形态好。利用优化的电转染条件得出最佳转染条件是：电压350 V、脉冲时间30 ms、电击1次、电击缓冲液成分为cell盐和options且V（cell盐）∶V（options）=3∶1、最佳温度4℃。
- 宋永利陆昕邱爽祁英培华松兰杰何小宁贺小英张涌郑月茂
- 关键词：巨噬细胞体外培养基因转染
- IPR1基因巨噬细胞特异性表达载体的构建及转IPR1基因牛克隆胚的制备
- 本课题从C57BL/6J小鼠肺组织通过RT-PCR法获得Ipr1 （intracellular pathogen resistance 1,细胞内病原体抗性基因1）基因的全长编码序列。构建了pEGFP-C1-Ipr1融合...
- 宋永利
- 关键词：转基因抗结核病体细胞核移植
- 文献传递
