许晓亚
- 作品数：5 被引量：6H指数：1
- 供职机构：河南师范大学生命科学学院更多>>
- 发文基金：河南省科技攻关计划河南省自然科学基金国家重点基础研究发展计划更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 豹蛙抗瘤酶的毕赤酵母高效表达、纯化及活性测定被引量：1
- 2015年
- 豹蛙抗瘤酶(Onconase,ranpirnase,ONC)对体内外多种肿瘤有很强的杀伤作用,是当前全球重点研究的100种新药之一,为获得高表达与高活性的重组豹蛙抗瘤酶(Recombination onconase,rONC),根据成熟ONC的cDNA序列和毕赤酵母密码子偏好性设计基因并提高其GC含量,分泌信号肽采用酵母α交配因子的pre肽,分别构建表达载体pPIC9/ONC、pPIC9K/ONC和pPICZα-A/ONC,并转染毕赤酵母X-33、GS115和SMD1168,筛选阳性克隆并进行诱导表达。在摇瓶规模筛选最佳载体-宿主组合及优化培养条件之后,进行10 L规模最优培养基的筛选,发酵产物经双水相萃取偶联G50凝胶层析分离纯化。结果表明,pPICZα-A/X-33/ONC组合表达量优于其他组合,且在p H 5.5、23℃条件下诱导7 d,最高表达量达到13 mg/L;在10 L规模条件下,rONC于pH 5.5的低盐基础培养基(Lower basic salt medium,LBSM)、甲醇浓度0.25%条件下诱导7 d,最高表达量为180 mg/L;纯化后的rONC纯度≥95%,收率高于90%;生物活性检测发现,rONC在体外能杀伤多种癌细胞。初步建立了rONC的高效表达与纯化体系,为后续的功能和作用机理研究奠定了一定基础。
- 杨刚刚马诚凯张全义史世会王泽吕中原王绪洋许晓亚崔晴晴张继红张瑞刚徐存拴
- 关键词：双水相萃取活性测定
- 重组豹蛙抗瘤酶促进大鼠肝癌RH-35细胞凋亡被引量：1
- 2016年
- 目的研究重组豹蛙抗瘤酶(r ONC)对大鼠肝癌RH-35细胞增殖和凋亡的作用。方法用不同浓度的r ONC处理体外培养的RH-35细胞,用SRB法检测细胞增殖;Hoechst染色法测定细胞活性;用流式细胞术检测细胞周期;用qRT-PCR和Western blot法检测相关基因和蛋白的变化。结果 r ONC作用于RH-35细胞24 h后呈时间和浓度依赖性,显著抑制增殖(P<0.05),IC_(50)为7.38μmol/L。rONC作用于RH-35细胞后,细胞核出现了显著的凋亡特征。G0/G1期的细胞比例显著上升(P<0.05),增殖能力减弱。r ONC作用于RH-35细胞后,BAX mRNA和蛋白水平升高(P<0.05),而PCNA,CCNA2和BCL-2 mRNA和蛋白水平降低(P<0.05)。结论 r ONC可能通过上调BAX表达和下调PCNA,CCNA2和BCL-2表达,促进RH-35细胞凋亡,抑制细胞增殖。
- 许晓亚靳伟杨刚刚张全义吕中原秦艳丽徐存拴
- 关键词：大鼠肝癌细胞细胞凋亡
- IL-18的毕赤酵母表达及其激活NF-κB和p38途径促进BRL-3A细胞增殖
- 2015年
- 目的：探讨白细胞介素18（IL-18）在毕赤酵母中的表达条件及其对BRL-3A细胞的增殖作用和作用机制.方法：构建表达载体p PIC9K-IL-18,电转化至毕赤酵母GS115,PCR、Western blotting和SDS-PAGE方法鉴定表达产物的正确性,并对发酵条件进行优化,再经双水相萃取偶联DEAE离子交换层析分离纯化表达产物.然后,MTT法检测重组大鼠IL-18（rr IL-18）对BRL-3A细胞的增殖作用,RT-PCR和Western blotting方法检测IL-18信号通路相关基因的表达变化.结果：在3 L发酵罐规模下600的菌体密度、p H=6.0、诱导温度23℃、体积分数分别为20%DO和0.25%甲醇浓度条件下表达质量浓度最高约为280 mg/L,经分离纯化后纯度可达95%.此外,质量浓度为15-20 ng/m L rr IL-18孵育48 h,能明显促进BRL-3A细胞增殖（P〈0.5）,且IL18R、My D88、NF-κB及其下游靶蛋白cyclin B1和cyclin B2的表达量均显著高于对照组（P〈0.5）.同时,p38途径的ATF2及其下游靶蛋白cyclin A2和Bcl-2的表达量也随之升高（P〈0.5）.结论：成功构建大鼠IL-18表达载体,优化在毕赤酵母中的发酵条件和纯化工艺,并首次证实IL-18能通过NF-κB和p38/ATF2途径激活细胞增殖相关靶蛋白cyclin B1、cyclin B2、cyclin A2和Bcl-2,进而促进BRL-3A大鼠肝细胞增殖。
- 张继红许晓亚杨刚刚马诚凯徐存拴
- 关键词：白细胞介素18毕赤酵母双水相萃取细胞增殖
- 重组人白细胞介素-1α在毕赤酵母中的表达、纯化及生物学活性检测
- 2015年
- 在毕赤酵母中分泌表达重组人白细胞介素-1α(rh IL-1α),优化rh IL-1α的发酵工艺及纯化方法,以获得高表达、高纯度具有生物学活性的rh IL-1α。通过PCR扩增获得h IL-1α基因,构建其真核表达载体p PICZαA/h IL-1α,电转化至毕赤酵母X-33,用PCR和SDS-PAGE方法筛选高效表达rh IL-1α的工程菌株并进行Western blot鉴定,DEAE弱阴离子离子交换层析一步纯化表达产物,并用MTT法初步检测其对人肝癌细胞7402的生物学作用。rh IL-1α在摇瓶规模下,经甲醇诱导4 d后表达量约为30 mg/L。Western blot检测rh IL-1α的特异性结合,获得纯度约95%,收率40%左右的rh IL-1α,并证明rh IL-1α能够抑制人肝癌细胞7402的增殖。构建了重组h IL-1α的基因工程菌,并在毕赤酵母中实现了高效表达,为进一步研究其生物学活性和功能奠定了基础。
- 李斌许晓亚杨刚刚崔晴晴杨亚娟徐存拴
- 关键词：毕赤酵母纯化人肝癌细胞
- 豹蛙抗瘤酶与人血清白蛋白融合蛋白的毕赤酵母高效表达与活性测定被引量：4
- 2015年
- 豹蛙抗瘤酶(Onconase,ONC),又称豹蛙酶,对多种肿瘤细胞和实体瘤具有显著杀伤作用,为得到高表达的ONC,利用HSA在毕赤酵母系统中的表达优势,将HSA和ONC融合进行毕赤酵母表达并分离纯化。设计融合基因HSA-(Gly4Ser1)3-ONC,简称HSA-ONC,构建至3种表达载体p PIC9、p PIC9K、p PICZα-A并分别转染X-33、GS115和SMD1168 3种宿主菌,在摇瓶和10L规模优化表达条件和双水相偶联柱层析分离纯化目的蛋白并测定其生物学活性。结果显示,在1 L摇瓶规模下,p PICZα-A/X-33/HSA-ONC组合的表达量优于其他组合,且在p H7,温度23℃条件下诱导10 d,表达量达到最高(235 mg/L)。在10 L规模进行不同培养基条件的发酵,r HSA-ONC于p H 7的低盐基础盐培养基(Low salt basic salt mediu m,LS-BSM),甲醇浓度0.25%条件下诱导10 d,表达量达到最高(2.02 g/L)。经双水相萃取偶联DEAE离子交换层析可得到纯度≥95%、收率高于70%的r HSA-ONC。生物活性检测发现,r HSA-ONC在体外能抑制多种癌细胞增殖。r HSA-ONC的表达量较r ONC提高1倍(同等摩尔量情况下),同时在体外抑制多种癌细胞增殖。
- 杨刚刚马诚凯史世会张全义王泽吕中原王绪洋许晓亚崔晴晴张继红丁一徐存拴
- 关键词：双水相萃取
