张瑞祥
- 作品数：3 被引量：3H指数：1
- 供职机构：复旦大学生命科学学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金浙江省科技计划项目更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 一段检测锥虫特异性核酸靶序列的筛选及评价被引量：1
- 2017年
- 目的以60S核糖体蛋白L44(60S RPL44)基因为靶基因,筛选出一段可特异性检测锥虫属(Trypanosoma)原虫的核酸靶序列,并对其敏感度和特异性进行初步评价。方法将布氏锥虫指名亚种(T.brucei brucei)的60S RPL44基因序列与公共数据库中田鼠巴贝虫(Babesia microti)、杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、恶性疟原虫(P.falciparum)和刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)等24种非锥虫属常见的血源性原虫,以及8种锥虫属内其他种的同源序列进行比对。同时,利用Primer Premier 6对布氏锥虫指名亚种的60S RPL44基因序列设计多对引物,结合序列比对结果和各引物评价情况,从中筛选出一对评价情况良好且理论上仅能扩增锥虫属靶序列的引物。利用该对引物检测布氏锥虫指名亚种、布氏锥虫罗德西亚种(T.b.rhodesiense)、刚果锥虫(T.congolense)、伊氏锥虫(T.evansi)以及上述5种其他属原虫,评价其特异性。采用梯度稀释(10 ng/μl、1 ng/μl、100 pg/μl、10 pg/μl、1 pg/μl)的伊氏锥虫基因组DNA为模板评价其敏感度。结果选出一段基于60S RPL44的特异性序列,针对该序列的扩增引物为P1:5′-CCTGATGAAAGGTGCAATG-3′,P2:5′-CGTTTTCGCCTTCTTGTGGA-3′。该引物扩增布氏锥虫指名亚种、布氏锥虫罗德西亚种、刚果锥虫、伊氏锥虫的DNA均为阳性,扩增片段长156 bp;扩增田鼠巴贝虫、杜氏利什曼原虫、间日疟原虫、恶性疟原虫、刚地弓形虫等非锥虫属原虫均为阴性;该引物检测伊氏锥虫DNA的敏感度为10 pg/μl。结论筛选获得一段敏感度较高、特异性强的检测锥虫属原虫的核酸靶标序列。
- 洪清华王韵丞李鸿雁张瑞祥李健陈木新刘骁殷明波王敬文胡薇
- 关键词：PCR检测靶序列
- 日本血吸虫胰凝乳蛋白酶样蛋白基因功能的初步研究被引量：2
- 2015年
- 目的探索日本血吸虫胰凝乳蛋白酶样蛋白(chymotrypsin-like protease)在终宿主体内的基因表达、定位和潜在功能,评估该蛋白在小鼠抗血吸虫感染中的免疫保护力。方法利用软件分析日本血吸虫胰凝乳蛋白酶样蛋白(Sj CTRL)基因(Gen Bank登录号为FN317561.1)的理化特性,及与其他物种同源基因的种系发生关系。采用整体原位杂交法定位Sj CTRL基因转录本在d26成虫中的表达部位。利用实时定量荧光PCR方法监测感染后14、18、22和26 d等4个发育时期雌雄虫的Sj CTRL基因转录水平。制备Sj CTRL-ds RNA,采用体外浸泡法对d26合抱雌雄虫进行RNA干扰,并利用共聚焦显微镜观察被干扰虫体的形态学变化。设计特异性引物扩增去除跨膜结构的编码基因序列,并克隆至p ET-28a原核表达载体,转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)后进行原核表达。将纯化重组蛋白免疫C57BL/6小鼠,用尾蚴(40±2条/鼠)攻击感染进行动物保护性实验。同时设对照组。感染后35 d收集虫体和肝脏,统计减虫率、每克肝组织减卵率。结果原位杂交定位结果显示,该基因转录本位于雌虫后段肠道。Sj CTRL基因仅在d26雌虫体内有较高的转录本丰度。Sj CTRL-ds RNA干扰后雌虫相应基因转录本的相对表达量降至25.7%(P<0.05),但未有可观察到的形态学变化。构建了p ET-28a/Sj CTRL重组质粒,诱导表达获得不可溶重组蛋白。免疫保护试验结果显示,减虫率为25.4%,减卵率为80.5%。结论初步探明日本血吸虫胰凝乳蛋白酶样蛋白基因仅在d26雌虫的后段肠道高转录,体外干扰可降低Sj CTRL基因的转录本水平,该蛋白可一定程度上减少感染日本血吸虫的C57BL/6小鼠的成虫数和肝脏虫卵数。
- 柴日奕王吉鹏李健张瑞祥李青刘牧辛玥徐斌胡薇
- 关键词：日本血吸虫原位杂交免疫保护
- 过继转移RNA干扰日本血吸虫的发育表型评价技术的建立
- 2018年
- 目的建立RNA干扰后的日本血吸虫转移至小鼠体内发育情况的评价技术,为后组学时代功能基因研究提供工具。方法设计引物扩增日本血吸虫组织蛋白酶B1(SjCB1)基因dsRNA、绿色荧光蛋白(GFP)dsRNA。用日本血吸虫尾蚴感染小鼠,收集14 d的日本血吸虫童虫。用6 mg/L SjCB1 dsRNA体外培养浸泡法对日本血吸虫童虫的SjCB1基因进行特异性敲低(SjCB1干扰组),对照组加6 mg/L GFP dsRNA(GFP干扰组)。采用外科手术将干扰后的童虫过继转移至小鼠肠系膜静脉(SjCB1干扰组、GFP干扰组各3只小鼠,40条/鼠),待虫体发育至性成熟时收集虫体。统计分析雌雄虫回收数量、合抱率、虫体回收率以及虫体长度,观察虫体生长发育情况。采用荧光定量PCR检测干扰后的14 d雌、雄童虫以及回收的雌、雄成虫SjCB1基因的表达情况。结果SjCB1干扰组、GFP干扰组回收的雌、雄虫数量,合抱率,虫体回收率分别为(9.0±1.4)、(9.0±2.1)条,(13.0±2.9)、(11.3±2.5)条,100%、100%和58.60%、54.67%。两组雌、雄虫数量,合抱率,虫体回收率差异均无统计学意义(P>0.05)。SjCB1干扰组过继转移前雌、雄童虫SjCB1基因的相对表达量为1.022±0.019、0.643±0.105,均低于GFP干扰组的2.880±0.297、2.753±0.164(t=0.000、0.000,P<0.01);SjCB1干扰组回收的雌、雄虫SjCB1基因相对表达量分别为1.286±0.211、1.182±0.287,均低于GFP干扰组的5.506±0.326、4.986±1.230(t=0.013、0.000,P<0.01)。SjCB1干扰组、GFP干扰组雌虫长分别为(7.059±1.255)、(8.433±0.749)cm,雄虫长分别为(6.993±2.734)、(10.561±1.375)cm,两组间雌、雄虫差异有统计学意义(t=0.003、0.001,P<0.01)。SjCB1干扰组、GFP干扰组虫体外观形态及内部的生殖系统、消化系统未见差异,两组雌虫在卵模与子宫中均有成形的虫卵。结论建立了干扰特异性基因后观察虫体体内发育表型的技术,体外培养浸泡干扰后日本血吸虫童虫、成虫SjCB1基因表达水平被�
- 柳建发李健任怡静张瑞祥方芳胡薇
- 关键词：日本血吸虫RNA干扰过继转移
