张雅婷
- 作品数：9 被引量：10H指数：2
- 供职机构：武汉生物制品研究所有限责任公司更多>>
- 发文基金：国家科技重大专项“重大新药创制”科技重大专项更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 表达全人源抗人IgE单抗的细胞株构建及筛选被引量：2
- 2015年
- 目的:构建及筛选高效表达原创性全人源抗人Ig E单克隆抗体的重组工程细胞株。方法:将采用核糖体展示技术筛选到的原创性全人源抗人Ig E单链抗体(sc Fv)基因改构设计为Ig G1κ型全长抗体,构建重组真核表达质粒并电转染CHO-S细胞,Dot-blot法选取多株高表达克隆进行40ml摇瓶批次培养,再据细胞生长特征及抗体表达量选取高表达克隆进行40ml摇瓶及3L摇瓶流加培养研究,选取候选细胞株并对改构前后抗体的生物学活性进行比较研究。结果:成功构建了p MH3-H、p MH3-L、p CApuro-H、p CApuro-L四种重组真核表达质粒并成功共转染CHO-S细胞。完成了4次电转染8轮细胞克隆筛选,获得两株表达量较高的候选克隆Mab1#和Mab2#,在3L摇瓶流加培养中抗体表达量分别达到470mg/L及499mg/L。生物膜光干涉技术(Bio-Layer Interferometry,BLI)亲和力结果显示Mab1#及Mab2#两株单抗亲和力均达到nmol/L级(10-9),与现有唯一上市的抗人Ig E单抗药物奥马珠单抗(Omalizumab)的亲和力相当。选取Mab1#全长抗体与其改构前的母本单链抗体的表面等离子共振技术(surface plasmon resonance,SPR)中和活性比较结果显示Mab1#抑制h Ig E与FcεRI结合的EC50为3nmol/L,EC90为9nmol/L,较改造前亲和力提高了4.3倍,中和活性(EC50)提高了23.7倍,中和活性(EC90)提高了41.3倍。结论:成功将表达原创性全人源抗人Ig E的单链抗体(约25k Da)改造为亲和力及中和活性均大幅提升的全长抗体(约150k Da),获得2个候选细胞株。
- 张银川刘萌萌张雅婷桂芳张爱华闭兰潘勇兵
- 关键词：单克隆抗体细胞株
- 全人源抗人肿瘤坏死因子α单克隆抗体注射液对食蟹猴的长期毒性试验被引量：1
- 2015年
- 目的评价全人源抗人肿瘤坏死因子α单克隆抗体(抗-h TNF-αFHMA)注射液对食蟹猴的长期毒性。方法将40只食蟹猴随机分成5组,分别为阴性对照组、阿达木单抗10 mg·kg^(- 1)对照组和抗-h TNF-αFHMA 2,10和50 mg·kg^(- 1)组,经皮下注射每周给药1次,连续给药5次,停药后恢复期4周。实验期间进行临床观察、体质量、体温、心电图、血细胞计数、凝血功能、血液生化、尿液、眼科、免疫指标、脏器及组织病理观察,同时进行血药浓度检测,分析毒代动力学参数。结果实验期间各组食蟹猴的观察、体质量、体温、心电图参数、眼科检查、血细胞计数、凝血功能、血生化、尿液分析、淋巴细胞亚群、细胞因子、血清免疫球蛋白和血清补体等指标均未见与给药相关的具有毒理意义的改变;抗-h TNF-αFHMA和阿达木单抗均可引起食蟹猴体内产生抗药抗体,且具有中和活性。抗-h TNF-αFHMA在体内基本呈线性动力学特征。相同剂量下与阿达木单抗呈现相似的免疫原性和代谢动力学特征。结论抗-h TNF-αFHMA未观察到不良反应的剂量为50 mg·kg^(- 1),相当于临床拟用剂量(0.67 mg·kg^(- 1))的75倍,表明抗-h TNF-αFHMA临床应用安全性较好。
- 张囡王炯张雅婷宋刚詹珊珊潘勇兵
- 关键词：阿达木单抗毒性试验
- 全人源抗人肿瘤坏死因子-α单克隆抗体毛细管等电聚焦鉴别方法的建立及验证
- 2016年
- 目的建立用于全人源抗人肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)单克隆抗体鉴别的毛细管等电聚焦(capillary isoelectric focusing,c IEF)方法,并进行验证。方法通过优化c IEF过程中各关键实验参数,如阴极稳定剂浓度、阳极稳定剂浓度、两性电解质浓度、3-10与8-10.5两性电解质比例、聚焦时间、聚焦电压,建立c IEF方法,并对方法的专属性、重复性、中间精密度进行验证。结果确定c IEF方法的实验参数为:阴极稳定剂浓度30 mmol/L,阳极稳定剂浓度3.2 mmol/L,3-10两性电解质在样品溶液中体积比为6.0%,聚焦电压为25 k V,聚焦时间为10 min。保护剂在样品出峰时间无紫外吸收峰,阳性对照阿达木单抗与样品出峰时间及峰形一致,阴性对照利妥昔单抗生物类似药、贝伐珠单抗、曲妥珠单抗生物类似药、西妥昔单抗与样品出峰时间及峰形均不一致,且对样品无干扰;样品制备重复性主峰等电点的相对标准差(relative standard deviation,RSD)为0.114%,中间精密度RSD为0.837%。结论建立的c IEF方法 p H梯度和精密度良好,专属性较强,适用于制品的批放行鉴别试验。
- 杨兰兰张银川吴小丽张雅婷桂芳吴师师闭兰潘勇兵
- 关键词：肿瘤坏死因子-Α单克隆抗体
- 结核DNA疫苗质粒pVAX1-Rv3407的构建及体外表达被引量：3
- 2012年
- 目的构建结核DNA疫苗质粒pVAX1-Rv3407,并检测其在哺乳动物细胞293T中的表达。方法以基因重组卡介苗(rBCG)AERAS-422基因组为模板,PCR扩增Rv3407基因,构建真核表达质粒pVAX1-Rv3407,转染293T细胞,采用免疫荧光法及Western blot法检测Rv3407蛋白的表达。结果 PCR扩增获得长300 bp的Rv3407基因片段;重组真核表达质粒pVAX1-Rv3407经双酶切及DNA测序证明构建正确;转染48 h后,Rv3407蛋白在293T细胞中有效表达,且主要分布在细胞质中。结论成功构建了结核DNA疫苗质粒pVAX1-Rv3407,为新型结核病疫苗的研制奠定了基础。
- 刘蓉娜方习静张爱华杨晓明张雅婷闭兰
- 关键词：分枝杆菌结核疫苗DNA
- 全人源化抗人TNF-α单克隆抗体毛细管区带电泳鉴别方法的建立及验证
- 2016年
- 目的建立及验证用于全人源化抗人TNF-α(Tumor necrosis factor-α)单克隆抗体(简称抗人TNF-α单抗)鉴别的毛细管区带电泳(Capillary zone electrophoresis,CZE)方法。方法采用DB-1毛细管,以样品检测分离度、迁移时间、电流及峰形为判断标准,筛选CZE过程中的各种参数(缓冲液p H、ε-氨基乙酸浓度、乙酸钠浓度、羟丙基纤维素浓度、样品稀释剂、进样时间及运行电压等),建立CZE方法,并对方法的专属性、精密度、中间精密度进行验证。结果建立的CZE方法参数条件为:缓冲液p H为5.0,EACA浓度为300 mmol/L,乙酸钠浓度为20 mmol/L,HPMC质量分数为0.05%,用50 mmol/L Tris稀释样品,进样时间为15 s,运行电压为20 k V。样品制备重复性主峰迁移时间RSD为0.459%,中间精密度RSD为1.145%。结论 CZE方法分离度高、专属性强、重复性和精密度好、简单快速,可作为全人源化抗人TNF-α单抗的鉴别方法。
- 杨兰兰桂芳张银川张雅婷潘勇兵闭兰吴小丽
- 关键词：人肿瘤坏死因子Α单克隆抗体毛细管区带电泳
- 抗人TNF-α单克隆抗体液质联用肽图分析方法的建立及验证被引量：4
- 2017年
- 目的:建立液相色谱-质谱联用肽图分析方法用于抗人肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor alpha,TNF-α)单抗的专属性鉴别。方法:TNF-α单抗样品经盐酸胍变性、还原,释放出的游离半胱氨酸残基进行烷化,还原剂中和过量的烷化剂。超滤置换酶切缓冲液后进行胰酶酶切并终止。色谱条件:采用Waters UPLC BEH 300 C_(18)(2.1 mm×150mm,1.7μm)色谱柱,以0.1%甲酸水溶液(A)-0.1%甲酸乙腈溶液(B)为流动相,梯度洗脱(5-120 min,2%B→45%B),流速为0.2 mL·min^(-1),检测波长为214 nm;质谱条件:采用电喷雾离子源及正离子模式,数据采集范围m/z为100~1990。结果:TNF-α单抗重链及轻链的6个互补决定区(CDR)对应肽段由质谱鉴定出,HC CDR2及HC CDR3在色谱峰图中共流出;利妥昔单抗用于评估本方法的专属性,结果显示本方法专属性强,且不受基质的干扰;选定m/z 1 344(M^(+5))的色谱峰为参考峰,根据CDR的相对保留时间考察该方法的变异程度,5次重复测定CDR相对保留时间的RSD在0.57%~1.19%之间;中间精密度考察测定的相对保留时间的RSD在0.00%~1.08%之间;胰酶酶切比例在20:1~30:1,酶切时间在17~23h范围内变化时,相对保留时间的均较小,符合方法耐用性的要求;样品消化后在8℃储存24h以及-20℃储存5d的稳定性良好。结论:基于CDR相关肽段鉴别的液质联用肽图分析方法可定性鉴定出TNF-α单抗,方法学验证结果显示该方法适用于抗人TNF-α单抗的专属性鉴别,可用于其质量控制及批检验放行。
- 桂芳杨兰兰潘勇兵张雅婷张银川
- 关键词：单克隆抗体液质联用
- 表达全人源抗人IgE单抗的候选细胞株鉴定及筛选
- 2015年
- 目的:鉴定及筛选表达原创性全人源抗人Ig E单克隆抗体的候选工程细胞株。方法:对实验室前期筛选到的Mab1#及Mab2#2个候选细胞株的3 L摇瓶流加培养12 d并经Protein A一步柱层析纯化的抗体样品,进行紫外光谱全波长扫描,采用LC-MS测定精确相对分子质量进行鉴别,采用SDS-PAGE(还原型及非还原型)进行分子完整性分析,采用SEC-HPLC进行集聚倾向性分析,采用IEF进行等电点(p I)测定及对N-糖苷酶(PNGase F)酶切前后样品的电荷进行比较分析,采用CEX-HPLC进行电荷异质性分析。同时,对Mab1#及Mab2#2个候选细胞株的3个月传代稳定性进行比较研究。结果:Mab1#及Mab2#2个候选细胞株表达抗体的紫外最大吸收波长均为280 nm;LC-MS轻链相对分子质量分别为23 464.82和23 465.06,重链(G0F糖型)相对分子质量分别为50 807.50 Da和50 807.48 Da,均与理论预期相符;SDS-PAGE(还原型及非还原型)电泳结果显示表达的抗体分子完整性好;SEC-HPLC聚集倾向分析显示2株单抗经一步Protein A亲和柱层析后的可溶性聚合体的含量均小于2%;IEF结果显示Mab1#和Mab2#p I分别为8.38和8.44,PNGase F酶切前后未见明显的由于糖基化修饰引起的电荷变异体。CEX-HPLC结果显示2株单抗的电荷均一性好,酸性变体及碱性变体含量之和均小于4%。完成的3个月细胞株稳定性研究结果显示Mab1#及Mab2#2株克隆均稳定。结论:Mab1#及Mab2#2个候选细胞株具有相似的目标抗体表达量、表达抗体的质量(分子完整性、聚集倾向、电荷异质性、亲和力)、以及细胞稳定性特征和细胞生长代谢特征等质量属性,均符合制定的阶段筛选目标。
- 张银川潘勇兵刘萌萌桂芳张雅婷张爱华闭兰
- 关键词：细胞株
- 抗肿瘤坏死因子-α单克隆抗体体外生物学活性检测方法的优化及验证
- 2015年
- 目的优化抗肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)单克隆抗体体外生物学活性的检测方法,并进行验证。方法对TNF-α单克隆抗体体外生物学活性检测方法中的结晶紫染色液浓度、细胞浓度、放线菌素D(Act D)浓度及TNF-α杀伤浓度进行优化,并对该方法的精密度及专属性进行验证。绘制质量控制图,对抗TNF-α单克隆抗体样品进行20次重复检测。结果结晶紫染色液、细胞浓度、Act D和TNF-α的最适浓度分别为0.2%、1.5×105个/ml,1 ng/ml和0.8μg/ml。同一人员于不同日6次重复测定参考品的半数有效浓度(ED50)均值为(44.18±6.858)ng/ml,相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为15.522%;不同日由3位不同人员重复测定参考品的ED50均值为(41.19±3.05)ng/ml,RSD值为7.40%;在TNF-α浓度一定的情况下,随着抗TNF-α单克隆抗体和阳性对照Humira浓度的降低,细胞的存活率随之降低,其他抗体无此现象。抗TNF-α单克隆抗体样品的20次测定结果均成立。结论成功优化了抗TNF-α单克隆抗体体外生物学活性检测方法的条件,该方法具有良好的精密度及专属性。
- 潘勇兵张雅婷张银川宋桂芝桂芳闭兰
- 关键词：肿瘤坏死因子-Α单克隆抗体生物学活性
- 应用小鼠肝坏死模型分析重组全人源抗肿瘤坏死因子-α单克隆抗体的体内中和活性
- 2015年
- 目的建立小鼠肝坏死模型,分析重组全人源抗肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)单克隆抗体的体内中和活性。方法确定D-半乳糖胺(D-galactosamine,D-Gal N)的致敏时间及TNF-α对C57BL/6小鼠的致死剂量;采用D-Gal N致敏小鼠,经腹腔注射TNF-α建立小鼠肝坏死模型,并测定3批供试品(抗TNF-α单抗)和3批阳性对照(阿达木单克隆抗体注射液)的体内中和活性,采用Probit回归拟合对活性测定结果进行分析。结果确定DGal N的致敏时间为10 min;TNF-α的致死剂量为100μg/kg体重;Probit回归拟合分析显示,拟合度较好,3批供试品对C57BL/6小鼠的半数有效剂量(ED50)分别为0.505、0.434和0.609 mg/kg,3批阳性对照对C57BL/6小鼠的ED50分别为0.455、0.571和0.484 mg/kg,供试品与阳性对照对C57BL/6小鼠的体内中和活性差异无统计学意义(P>0.05)。结论联合应用D-Gal N和TNF-α可造成小鼠肝坏死,从而导致小鼠死亡,抗TNF-α单抗可阻断其效应。抗TNF-α单抗对TNF-α的抑制作用呈剂量-效应关系。
- 张雅婷潘勇兵张银川张坤明任彬宋桂芝桂芳闭兰
- 关键词：肿瘤坏死因子-Α中和活性
