金永
- 作品数：15 被引量：14H指数：2
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- 相关领域：医药卫生生物学农业科学更多>>
- 整合高拷贝数猪源转录因子的猪胎儿成纤维细胞系的建立
- 2017年
- 目的:对猪primed胚胎干细胞、囊胚内细胞团(inner cell mass,ICM)和胎儿成纤维细胞(porcine embryonic fibroblasts,PEF)转录组比较分析,在筛选出ICM中表达水平上调的5个转录因子(OCT4、TBX3、REX1、LIN28及DPPA5)的前期研究基础上,尝试构建具有2A肽(2A peptide)基因序列的转录因子重组表达载体,并与p EF1a-Tet3G质粒共转染PEF细胞,以期获得同时转入5个转录因子的单克隆细胞系,为讨论利用Tet-On 3G诱导表达系统并通过添加盐酸多西环素(doxycycline hyclate,DOX)激活转录因子表达,高效诱导形成猪诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS)的相关研究奠定基础。方法:以PEF细胞c DNA为模板,利用PCR方法扩增获得猪源REX1、LIN28、DPPA5 3个转录因子,并将3个转录因子以E2A和T2A序列连接成三因子片段(RLD),最终将三因子片段及商业合成的OCT4和TBX3连接到改造后的诱导表达载体p TRE3G-Zs中,获得3个重组表达载体;利用核转染的方法,将3个重组诱导表达载体与表达反式激活蛋白的p EF1a-Tet3G质粒共转染PEF细胞,并通过药物筛选和鉴定获得单克隆转基因细胞系。结果:扩增获得带有2A肽序列的猪源转录本片段REX1(975bp)、LIN28(727bp)和DPPA5(408bp),并获得2A肽序列连接成的三因子片段RLD,最终构建了3个表达载体(p TRE3G-Zs-OCT4、p TRE3G-Zs-TBX3、p TRE3G-Zs-RLD),且经酶切鉴定证明载体连接正确;3个表达载体与p EF1a-Tet3G质粒核共转染PEF细胞后,经过药物筛选和外源基因鉴定,共获得同时转入五因子的单克隆细胞系70个,其中29个细胞系外源基因拷贝数较高。结论:成功建立了具有高拷贝数猪源OCT4、TBX3、REX1、LIN28、DPPA5 5个转录因子的单克隆转基因细胞系。
- 张曼玲陈袁赵丽华李艳如金永王俊政姜海滨陈俏羽李荣凤
- 关键词：IPS细胞
- GGTA1/CMAH/β4GalNT2三基因敲除猪作为异种心脏瓣膜供体
- 张润洁王荣根方斌李楚陈雷任雪洋厉小雪熊强张立宁金永张曼玲刘晓蕊王盈杨海元李荣凤戴一凡
- CRISPR/Cas9介导的猪Six1和Six4基因敲除细胞系的建立被引量：1
- 2018年
- 目的:利用干细胞囊胚互补技术再生同种或异种动物器官已得到验证,其重要的前提是需要构建出相应的器官缺失动物模型。本文拟通过CRISPR/Cas9基因编辑技术建立猪Six1单基因和Six1/Six4双基因敲除猪细胞系,为构建肾脏发育缺陷和缺失猪模型奠定重要的研究基础。方法:选取猪Six1基因和Six4基因第一外显子为敲除靶点,分别设计并合成单导向RNA(single guide RNA,sg RNA),将其插入含有Cas9骨架的PX330质粒,分别构建Six1基因和Six4基因敲除打靶载体PX330-sg RNA1和PX330-sg RNA4;用T7EN1酶验证打靶载体敲除效率后,将高效打靶载体与含G418抗性的质粒(p CMV-td Tomato)共转染原代猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts,PFFs)中,并通过药物筛选获得单克隆细胞群落,随后对单克隆细胞进行基因型鉴定。结果:分别成功构建Six1和Six4基因的Cas9/sg RNA表达载体。转染Six1基因打靶载体经药物筛选后,利用PCR方法鉴定所获得的Six1基因敲除单克隆细胞系48个,其中Six1-/-细胞系21个。通过同样方法同时转染Six1基因和Six4基因打靶载体,经药物筛选后共获得44个单克隆细胞系,其中Six1-/-Six4-/-细胞系为13个。结论:通过CRISPR/Cas9基因编辑技术可高效获得Six1单基因敲除细胞系和Six1/Six4双基因敲除细胞系,为构建肾脏发育缺陷猪动物模型提供了基础,并有助于研究Six1和Six4基因在猪肾脏发育中的功能。
- 王俊政李艳如赵丽华刘曼菱张曼玲金永陈俏羽王晨宇尤志欢李荣凤
- 胎猪肾脏发育不同时期相关信号分子的表达被引量：3
- 2019年
- 目的:明确不同时期胎猪的肾脏发育情况,并研究胎猪肾脏发育相关信号分子的表达。方法:收集不同时期(妊娠21.5、27.5、35.0、45.0、75.0及110.0 d)胎猪肾脏组织,应用HE法观察不同时期胎猪肾脏的组织结构。通过实时荧光定量PCR和Western blot分别检测肾脏发育相关信号分子(Pax2、Pax8、Six2、Six1、Sall1和Bmp4)的mRNA和蛋白表达水平,并通过免疫组织化学检测Pax2在不同时期胎猪肾脏的表达定位情况。结果:27.5 d胎猪的后肾已经开始发育;35 d早期肾小体已经出现,肾小管也开始发育;45 d观察到近皮质不成熟的肾小体和近髓质成熟的肾小体;75 d肾单位数目显著增加,观察到肾椎体、肾乳头和肾盂;110d肾脏基本发育成熟,皮髓质分界明显,仍有新的肾单位产生。Pax2、Pax8、Six2、Six1、Sall1和Bmp4在胎猪75d的肾脏中mRNA和蛋白表达量高于35 d。Pax2广泛表达于输尿管芽、后肾间充质、帽状间充质、肾小囊体、逗号形体、S形体以及肾小管,并在后肾发育过程中持续表达。结论:27.5 d时胎猪后肾已经开始发育,110 d基本发育成熟。Pax2、Pax8、Six2、Six1、Sall1和Bmp4等信号分子在胎猪肾脏发育过程中均有不同程度表达,其中Pax2可能是胎猪肾脏发育的关键调控分子。
- 刘曼菱赵丽华张曼玲金永王晨宇尤志欢张红李荣凤
- 关键词：肾脏发育PAX2
- 猪naive-like胚胎干细胞向神经细胞体外诱导分化
- 2019年
- 目的:将猪naive-like胚胎干细胞体外定向诱导分化为神经细胞,为猪多能干细胞诱导神经分化方法的建立提供参考。方法:利用小分子化合物β-巯基乙醇、B-27、肝素等组成的神经诱导培养液,采用直接分化法,分化得到神经样细胞,对其进行神经特异性基因表达鉴定,同时检测分化后的细胞是否已经丧失多能性。结果:分化所得到的神经细胞具有明显的神经细胞结构特征,RT-PCR和免疫荧光结果显示分化后的神经细胞表达多种神经细胞特异性基因,qPCR结果显示分化后多能因子的表达显著降低,神经特异性基因表达显著升高,免疫荧光结果经统计分析后显示,低分子量神经微丝蛋白(light neurofilament protein,NF-L)阳性细胞率可达79%。结论:成功实现了体外直接诱导猪naive-like胚胎干细胞向神经细胞分化,为神经系统疾病修复与治疗研究奠定了基础。
- 王晨宇张曼玲姜海滨金永赵丽华刘曼菱陈俏羽王俊政尤志欢张红李荣凤
- 关键词：神经细胞诱导分化
- GGTA1/β4GalNT2双基因敲除近交系五指山小型猪的建立被引量：6
- 2019年
- 目的:利用CRISPR/Cas9技术建立五指山小型猪近交系GGTA1/β4GalNT2双基因敲除克隆猪。方法:设计合成靶向猪GGTA1和β4GalNT2基因的单导向RNA(single guide RNA,sgRNA),以pX330质粒为骨架,分别构建GGTA1和β4GalNT2的Cas9打靶载体,转染至近交系五指山小型猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblast,PFF)中,通过G418药物筛选和测序鉴定获得双基因敲除的单细胞克隆,然后利用体细胞克隆技术(somatic cell nuclear transfer,SCNT)获得双基因敲除的近交系五指山小型猪,并利用流式细胞技术检测克隆猪外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中αGal和Sd(a)抗原的表达。结果:成功构建GGTA1和β4GalNT2基因的Cas9/sgRNA表达载体,转染后获得双基因敲除的近交系五指山小型猪PFF细胞克隆9个。SCNT成功获得了10只五指山小型猪近交系双基因敲除的克隆猪,其PBMC无αGal和Sd(a)抗原的表达。结论:CRISPR/Cas9技术可以实现对猪GGTA1/β4GalNT2基因的编辑。本实验首次成功制备了GGTA1/β4GalNT2双基因敲除的近交系五指山型猪,为异种器官移植研究与应用提供了新的供体材料。
- 李楚任雪洋李琳厉小雪金永张曼玲刘晓蕊熊强张立宁王盈李荣凤杨海元冯书堂戴一凡
- 关键词：异种移植
- 建立稳定表达猪LIF蛋白的小鼠STO细胞系被引量：1
- 2016年
- 目的:在STO小鼠成纤维细胞中表达猪白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF),并尝试使用其作为饲养层培养大鼠诱导多能性干细胞(i PS细胞)。方法:通过脂质体转染的技术,将已构建的猪LIF基因真核表达载体p CAG-p LIF转染至小鼠STO细胞中,获得能够稳定表达猪LIF的转基因STO细胞(STO-p LIF细胞)。通过RT-PCR、q PCR、Western blot等方法检测STO-p LIF细胞中猪LIF基因的表达量,选择高效表达猪LIF的STO-p LIF细胞作为饲养层,培养大鼠i PS细胞。通过生长曲线检测、碱性磷酸酶染色、干细胞多能因子的RT-PCR和免疫荧光染色等方法,检验STO-p LIF细胞饲养层在大鼠i PS细胞培养方面的功能。结果:STO-p LIF细胞中LIF RNA和蛋白表达水平均上调(P<0.05),而该细胞系作为饲养层所培养的大鼠i PS细胞在形态、多能性因子表达方面更接近于传统培养的大鼠i PS细胞,与无外源添加LIF所培养的大鼠i PS存在差异(P<0.05)。结论:成功获得了稳定表达猪LIF基因的STO-p LIF细胞,并证明该细胞作为饲养层在大鼠i PS细胞培养中具有一定优势。
- 陈袁赵丽华杨宁张曼玲金永侯道荣吴兆强李艳如姜海滨李荣凤
- 关键词：饲养层细胞
- 一种用于采集肾脏病患者尿液细胞的装置
- 本实用新型公开了一种用于采集肾脏病患者尿液细胞的装置，包括，支撑架；收集斗，所述支撑架的顶部活动插接有收集斗；插管，所述收集斗的底部固定插接有插管，所述插管的一侧固定安装有调节阀；安装机构，所述支撑架的内壁底部居中处固定...
- 金永张曼玲曹长春张浩
- 文献传递
- 猪naive-like诱导性多能干细胞系的建立及红色荧光蛋白标记被引量：1
- 2017年
- 目的 :建立猪naive-like诱导性多能干(induced pluripotent stem,i PS)细胞系,并对其进行红色荧光标记,为通过示踪猪naive i PS细胞发育和分化的相关研究奠定基础。方法:首先利用核转染技术向巴马小型猪胎儿成纤维细胞(porcine embryonic fibroblast,PEF)中转入鼠源OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC转录因子表达载体Tet O-FUW-OSKM,并同时转入激活表达载体FUW-M2rt TA,采用白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)结合碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,b FGF)的培养体系进行培养,通过在培养液中添加盐酸多西环素(doxycycline hyclate,DOX)进行诱导,建立起猪i PS细胞系,并对细胞系的多能性进行鉴定。在此基础上,向i PS细胞系转入红色荧光蛋白表达载体,对其进行标记,并鉴定被红色荧光标记后的细胞是否仍然具有多能性。结果:所建立的i PS细胞系克隆呈三维立体生长,可以进行单细胞传代培养至30代以上,核型正常,碱性磷酸酶染色呈阳性,表达多种干细胞多能因子,利用LIF/STAT3信号通路维持其增殖,体外可分化形成表达三胚层相关基因的类胚体,为猪naive-like i PS细胞系。成功对所建立的i PS细胞系进行红色荧光标记,碱性磷酸酶染色和免疫荧光染色结果显示被红色荧光标记的i PS细胞的多能性依然存在。结论:成功建立了稳定表达红色荧光蛋白的猪naive-like i PS细胞系。
- 姜海滨张曼玲赵丽华金永陈袁王俊政陈俏羽李荣凤
- 关键词：多能性红色荧光蛋白
- 一种急性肾损伤患者尿液细胞诱导多能干细胞的建立方法
- 本发明提出了一种急性肾损伤患者尿液细胞诱导多能干细胞的建立方法，包括如下步骤：步骤1、分离培养急性肾损伤患者的尿液肾脏细胞A，并分析细胞的染色体核型，以及免疫荧光鉴定肾脏特异性分子表达；步骤2、通过核转染技术将鼠源OCT...
- 金永张曼玲李荣凤曹长春
- 文献传递
