刘原
- 作品数：9 被引量：14H指数：2
- 供职机构：江苏大学临床医学院更多>>
- 发文基金：中国博士后科学基金国家自然科学基金江苏省博士后科研资助计划项目更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 人降钙素原的原核表达、纯化和鉴定被引量：2
- 2017年
- 目的构建人降钙素原(procalcitonin,PCT)原核表达载体,获得高纯度PCT重组蛋白。方法根据NCBI上PCT基因序列设计引物,利用PCR技术扩增PCT基因,构建PCT/p ET-22b(+)重组表达载体,转化至大肠埃希菌(E.coli)BL21中诱导表达;采用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白,用western blot和胶体金法对其进行鉴定。结果琼脂糖凝胶电泳结果显示PCR扩增产物约为350 bp。同源性比对分析结果表明,PCT基因片段(348 bp)成功插入p TG19-T载体,未出现碱基突变。用Bam HⅠ和HindⅢ对重组表达载体双酶切,得到约为350 bp和5 500 bp片段。SDS-PAGE电泳显示PCT重组蛋白以可溶性形式存在,Mr约14 000,经镍柱亲和层析法纯化后即可获得。western blot和PCT胶体金法结果呈阳性,显示融合蛋白含组氨酸标签(His-tag),成功表达出PCT重组蛋白。结论应用重组DNA技术成功构建PCT基因融合重组表达载体,通过蛋白质表达纯化技术获得PCT融合蛋白。
- 付涛苏丹华刘原刘卿吴亮陈盛霞姜旭淦
- 关键词：降钙素原原核表达纯化
- 弓形虫入侵的宿主细胞骨架重塑触发线粒体重新分布被引量：3
- 2015年
- 目的探讨宿主细胞骨架重塑在弓形虫侵入HFF细胞以及触发细胞线粒体重新分布中的作用。方法体外培养HFF细胞,预先用1μg/mL细胞松驰素D(CD)处理30min,接种弓形虫速殖子分别培养1h和20h,Western blotting检测弓形虫表面抗原(surface antigen,SAG)1蛋白表达。同时用MitoTrackerRed CMXRos荧光探针标记细胞线粒体,激光共聚焦显微镜下观察HFF细胞线粒体在弓形虫侵入前后和CD处理前后聚集和分布情况。结果感染后1h,CD处理组HFF细胞内虫体量与CD未处理组差异不大,20h时CD未处理组细胞内虫体量显著多于CD处理组。此时可见HFF细胞线粒体明显聚集成明亮点状且分布于纳虫泡周围,而未感染组细胞线粒体未见明显聚集分布。CD可以显著抑制弓形虫侵入HFF细胞后引起的线粒体聚集。结论触发宿主细胞骨架重塑是弓形虫侵入宿主细胞并引起细胞线粒体向纳虫泡聚集所必须的。
- 吴亮王晓苏丹华刘原付涛姜旭淦陈盛霞曹建平
- 关键词：弓形虫
- 单增李斯特菌感染抑制HepG2细胞RhoA表达并促进其凋亡被引量：5
- 2016年
- 目的探讨单增李斯特菌(Lm)调控Hep G2细胞的凋亡能力以及对Rho家族Rho A蛋白表达的影响。方法常规方法培养Hep G2细胞,分别以感染复数(MOI)=10和MOI=100接种Lm菌EGD株,共培养1 h和20 h后收集培养物。异硫氰酸荧光素标记的膜联素Ⅴ/碘化丙啶(annexinⅤ-FITC/PI)双染色结合流式细胞术检测细胞凋亡率,反转录PCR检测Hep G2细胞Rho A和caspase 3编码基因表达,分光光度法检测Hep G2细胞活化的caspase 3水平,Western blot法检测Hep G2细胞Rho A蛋白表达。结果 Lm的侵袭可促进Hep G2细胞凋亡,下调Hep G2细胞Rho A编码基因和蛋白表达,并上调caspase 3编码基因表达。结论 Lm感染促进宿主细胞凋亡,抑制宿主细胞Rho A表达。
- 吴亮韩新烨刘原苏丹华付涛姜旭淦陈盛霞许化溪
- 关键词：单增李斯特菌RHO细胞骨架凋亡
- RhoA因子在单增李斯特菌侵袭HepG2细胞中的作用
- 2016年
- 目的研究HepG2细胞的Rho家族RhoA因子在Lm侵袭中的作用。方法构建真核表达载体p3×FLAGMyc-CMV-24-RhoA,经脂质体法转染HepG2细胞,使HepG2细胞过表达RhoA;同时针对RhoA序列合成siRNA,脂质体法转染HepG2细胞,抑制HepG2细胞RhoA表达。2种细胞同时感染Lm,通过Real-time PCR检测HepG2细胞RhoA上调/下调时培养物中Lm-Hly基因拷贝数,评估Lm数量。结果HepG2细胞转染p3×FLAG-Myc-CMV-24-RhoA载体后,Western blotting法检测RhoA表达量升高,且48h升高显著,此时HepG2细胞内Lm数量明显低于对照组;HepG2细胞转染siRNA后,Western blotting法检测RhoA表达量降低,且72h降低显著,此时HepG2细胞内Lm数量明显高于对照组。结论Lm侵入受HepG2细胞RhoA因子调控,主动下调细胞RhoA因子表达可能是Lm侵袭机制之一。
- 吴亮王妍然刘原苏丹华付涛姜旭淦陈盛霞许化溪
- 关键词：单增李斯特菌细胞骨架RHOAHEPG2细胞
- Tet-on慢病毒系统表达弓形虫ROP18的研究被引量：2
- 2015年
- 目的用Tet-on慢病毒载体系统构建稳定表达弓形虫棒状体蛋白18(ROP18)的293T细胞株。方法PCR扩增ROP18基因序列插入慢病毒载体p LVCT-t TR-KRAB中,构建带有ROP18活性片段的慢病毒载体p LVCT-t TRKRAB-ROP18。经鉴定后将该重组载体(6μg)与辅助质粒ps PAX2(4μg)和p MD2.G(2μg)共同转染293T细胞,荧光显微镜下观察细胞荧光。于转染后48和72 h收集含有慢病毒颗粒上清液,感染293T细胞。以1μg/ml强力霉素(DOX)诱导293T细胞表达ROP18,荧光显微镜下观察细胞荧光,RT-PCR法检测293T细胞中的ROP18表达情况。结果 PCR扩增rop18片段为960 bp,与预期大小一致。经PCR和酶切鉴定重组慢病素载体构建成功。转染48 h后,293T细胞于荧光显微镜下可见绿色荧光。经DOX诱导24 h即可观察到293T细胞中明亮绿色荧光。RT-PCR检测结果显示,293T细胞ROP18可产生960 bp特异条带,与预期结果一致。结论采用Tet-on慢病毒载体系统构建了稳定表达弓形虫ROP18的293T细胞株。
- 王晓朱君吴亮吴腊梅刘原苏丹华丁宁赵康容姜旭淦陈盛霞曹建平
- 关键词：刚地弓形虫慢病毒
- 刚地弓形虫Peroxiredoxin多克隆抗体的制备及鉴定
- 2015年
- 目的原核表达刚地弓形虫过氧化物氧化还原酶(peroxiredoxin,Prx)并制备多克隆抗体。方法 PCR技术扩增弓形虫cDNA中的prx基因,克隆至pET-28a(+)载体,构建prx/pET-28a(+)重组表达载体,转化至大肠埃希菌(E.coli)Rosetta中诱导表达。亲和层析纯化重组Prx蛋白,并制备兔多克隆抗体,蛋白印迹技术对多克隆抗体进行鉴定。结果成功从弓形虫cDNA中扩增出prx目的基因,构建了prx/pET-28a(+)重组质粒,获得抗Prx重组蛋白的多克隆抗体。蛋白印迹技术检测出弓形虫Prx的特异性条带。结论重组弓形虫Prx制备的多克隆抗体能检测Prx在弓形虫速殖子表达。
- 苏丹华沈超群吴亮刘原付涛周家豪姜旭淦陈盛霞曹建平
- 关键词：刚地弓形虫原核表达多克隆抗体
- 刚地弓形虫硫氧还蛋白基因的克隆 表达及鉴定被引量：1
- 2016年
- 目的克隆刚地弓形虫硫氧还蛋白(Thioredoxin,Trx)基因,构建原核表达载体,通过诱导表达和纯化蛋白,免疫家兔制备多克隆抗体。方法采用PCR技术扩增刚地弓形虫Trx基因,克隆至原核表达载体p ET-28a(+)中,转化大肠埃希菌(E.coli)Rosetta,用IPTG诱导目的蛋白表达,采用镍亲和层析法获得纯化蛋白并免疫家兔制备多克隆抗体。利用Western blotting技术鉴定多克隆抗体的特异性。结果成功从刚地弓形虫c DNA中扩增出Trx目的基因,构建了Trx/p ET-28a(+)重组质粒,获得抗Trx重组蛋白的多克隆抗体。Western blotting技术检测出弓形虫Trx蛋白的特异性条带。结论用制备的兔抗Trx多克隆抗体能检测弓形虫Trx在速殖子内的表达,为进一步深入研究刚地弓形虫Trx功能奠定了基础。
- 张梓岗陈小美苏丹华刘原付涛端木家苗吴亮姜旭淦陈盛霞曹建平
- 关键词：刚地弓形虫硫氧还蛋白克隆原核表达多克隆抗体
- 弓形虫表面抗原1、棒状体蛋白18真核表达载体的构建与体外表达被引量：1
- 2015年
- 目的:构建刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)表面抗原1(surface antigen 1,SAG1)及棒状体蛋白18(rhoptry protein 18,ROP18)的真核表达重组质粒,并在真核细胞中表达目的蛋白。方法:设计SAG1、ROP18的特异引物,采用RCR技术从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码SAG1、ROP18基因片段,经克隆至p TG19-T载体后,亚克隆至真核表达载体p3×FLAG-Myc-CMVTM-24,构建真核表达重组质粒p3×FLAG-Myc-CMVTM-24-SAG1和p3×FLAG-MycCMVTM-24-ROP18。将构建好的真核表达重组质粒转染人肾上皮细胞系293-T细胞,分析转染细胞的表达情况。结果:PCR扩增弓形虫SAG1和ROP18基因片段分别为1 011 bp和1 665 bp,与预期大小相符。重组质粒经PCR、酶切和测序鉴定结果均正确,通过RT-PCR和蛋白质印迹技术鉴定出重组质粒p3×FLAG-Myc-CMVTM-24-SAG1和p3×FLAG-Myc-CMVTM-24-ROP18在293-T细胞中表达。结论:成功构建了真核表达质粒p3×FLAG-Myc-CMVTM-24-SAG1和p3×FLAG-Myc-CMVTM-24-ROP18,该重组质粒能够在真核细胞中表达目的蛋白。
- 吴腊梅吴婷吴亮王晓苏丹华刘原陶思佳魏逸青姜旭淦陈盛霞曹建平
- 关键词：刚地弓形虫SAG1真核表达质粒
- 弓形虫棒状体蛋白16的原核表达及多克隆抗体制备被引量：1
- 2015年
- 目的:克隆刚地弓形虫RH株速殖子棒状体蛋白(rhoptry protein,ROP)16基因,并构建ROP16基因的原核表达系统,检测和定位ROP16蛋白的表达。方法:以弓形虫RH株速殖子基因组DNA为模板,PCR扩增弓形虫ROP16基因,克隆至p ET-32a(+)载体,在大肠埃希菌Rosetta中诱导表达。经KCl染色切胶法纯化重组ROP16蛋白,并制备其兔多克隆抗体。采用蛋白质印迹法和间接免疫荧光法检测和定位ROP16在弓形虫速殖子内的表达。结果:成功表达并纯化重组ROP16蛋白,制备了其多克隆抗体。蛋白质印迹法检测出相对分子质量为74 000的特异性条带,间接免疫荧光实验显示ROP16分布于弓形虫速殖子胞质内。结论:经原核表达重组ROP16制备的多克隆抗体能检测和定位ROP16在弓形虫速殖子内的表达。
- 刘原杨华吴亮苏丹华付涛郭雪刘曼姜旭淦陈盛霞曹建平
- 关键词：刚地弓形虫原核表达
