杨晓菲
- 作品数：10 被引量：14H指数：2
- 供职机构：暨南大学第二临床医学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金广东省自然科学基金深圳市科技计划项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 小鼠iPSCs诱导分化为胰岛素分泌细胞及治疗糖尿病的实验研究
- 2016年
- 目的:利用3步法诱导方案,使小鼠诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)分化为胰岛素分泌细胞(insulin-producing cells,IPCs),观察诱导效率和成熟度,并观察其对糖尿病小鼠治疗效果。方法:本实验室通过piggy Bac转座子将C57/C雄性小鼠来源胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)构建为小鼠iPSCs,利用3步法诱导方案分化为IPCs,观察细胞分化过程中的形态变化;RT-PCR和免疫荧光检测其胰岛β细胞发育相关基因和蛋白的表达;流式细胞术分析分化效率;葡萄糖刺激实验检测胰岛素和C肽分泌水平。将IPCs移植入C57/C雄性糖尿病小鼠模型左肾包膜下,监测血糖和血清中胰岛素含量28 d,观察逆转高糖血症的效果。结果:建立的3步诱导方案可以将小鼠i PSCs诱导分化为IPCs,其表达胰岛β细胞的标志性基因(Pdx1、Ngn3、Pax6和Ins2)和蛋白(Pdx1、Nkx6.1和胰岛素),在葡萄糖刺激下可分泌胰岛素和C肽。流式细胞术结果表明诱导分化的效率达28%。移植后3 d糖尿病小鼠血糖即降低至接近正常水平,血清胰岛素含量明显升高,对葡萄糖的调控能力明显增强。病理学观察IPCs细胞移植28 d后仍存活。结论:建立的3步诱导法可将i PSCs高效定向诱导分化为IPCs,明显缩短了诱导分化的时间,移植至近交系同性别小鼠体内可逆转糖尿病的高糖血症。
- 任丽伟魏培杨晓菲杨璐邓春艳齐晖李富荣
- 关键词：诱导多能干细胞胰岛素分泌细胞糖尿病
- 移植途径对人脐带间充质干细胞治疗小鼠糖尿病效果的影响被引量：1
- 2017年
- 目的:观察不同途径移植人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)对小鼠糖尿病的治疗效果。方法:利用增强绿色荧光蛋白和萤光素酶报告系统(EGFP/Luc)标记hUCMSCs,通过胰腺包膜下途径或尾静脉途径将携带萤光标记的hUCMSCs移植到链脲霉素诱导的糖尿病模型小鼠体内。移植后利用萤光素酶报告基因追踪hUCMSCs在活体内的迁移和定位;组织学检测小鼠胰岛形态变化;功能学实验动态检测小鼠血糖、血清胰岛素水平和糖耐量。结果:活体生物发光成像显示胰腺包膜下途径移植的hUCMSCs主要定位于胰腺,尾静脉途径移植的hUCMSCs主要定位于肺,仅少量细胞向胰腺部位迁移。组织学检测发现,胰腺包膜下途径移植的小鼠胰岛边界清晰,无炎症细胞浸润;而尾静脉途径移植的小鼠胰腺组织有少量炎症细胞浸润和纤维化形成。功能学检测发现胰腺包膜下移植较尾静脉移植降低小鼠血糖作用显著,血糖可降至接近正常水平,且血清胰岛素水平明显升高,葡萄糖的调节能力显著增强。结论:移植途径对hUCMSCs治疗糖尿病的效果有影响。胰腺包膜下移植在降低小鼠血糖、升高胰岛素水平及改善胰岛功能方面均优于尾静脉移植。
- 蒋豆蔻李青杨晓菲李阳李富荣
- 关键词：人脐带间充质干细胞1型糖尿病
- CRISPR/Cas9基因编辑技术在糖尿病细胞治疗中的应用研究进展被引量：4
- 2019年
- 近几年来,基因编辑技术快速发展,为在特定位置精确操控基因组提供了一个有效而精确的工具。CRISPR/Cas9系统是一种新型的基因编辑工具,可实现对人类基因组的高精度修饰,是疾病建模和治疗的可行选择。随着CRISPR/Cas9系统技术的广泛应用,在糖尿病领域有不少相关研究出现。该文从干细胞分化为β细胞、基因编辑重编程为β细胞以及修饰基因三个方面总结了CRISPR/Cas9技术在糖尿病治疗中的应用。
- 王晗月杨晓菲胡巢凤李富荣
- 关键词：细胞治疗糖尿病
- R848联合Poly(I:C)促进DC抗原呈递和增强T细胞杀伤效果的研究被引量：2
- 2018年
- 目的:研究R848联合聚肌胞苷酸[Poly(I:C)]对树突状细胞(DC)成熟的影响及DC诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对人肺腺癌A549细胞的杀伤作用。方法:分离人外周血单个核细胞,诱导其成为DC,用A549细胞裂解物即肿瘤细胞裂解物(TCL)作为抗原,R848(Toll样受体7/8激动剂)联合Poly(I:C)(Toll样受体3激动剂)作用于DC,流式细胞术分析DC表面共刺激分子;将抗原刺激活化后的DC与T淋巴细胞混合培养7 d,收集培养上清液和CTL,检测上清液中白细胞介素12(IL-12)p70、干扰素γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量;CTL与肺腺癌A549细胞共培养16 h,观察其杀伤效果。结果:DC-R848+Poly(I:C)组DC表面CD83和CD80的表达较DC-TCL组显著提高(P<0.01);同时可明显刺激DC分泌IL-12 p70(P<0.01);此外,DC-R848+Poly(I:C)组较DC-TCL组对肺腺癌A549细胞杀伤效果亦显著提高(P<0.01);DC-R848+Poly(I:C)组IFN-γ和TNF-α的分泌水平较DC-TCL组均显著提高(P<0.01)。结论:R848联合Poly(I:C)作用于DC可显著促进其成熟、活化,并增强其抗原呈递作用及CTL对肺腺癌细胞的特异性杀伤作用。
- 黄雪王策陈尚杨晓菲郑媛媛王京波李富荣
- 关键词：树突状细胞细胞毒性T淋巴细胞肺腺癌
- 高效靶向激活肝细胞内源基因直接重编程为胰岛样细胞
- 2021年
- 背景:胰岛细胞移植是治疗糖尿病最有效的方法之一,然而移植细胞来源短缺限制了其临床应用。在体外进行肝细胞向胰岛β细胞的直接重编程是解决该问题的一个新思路,但肝细胞向胰岛β细胞分化是一个复杂的过程。目的:利用构建的CRISPR/dCas9-Pumilio系统(Casilio系统),通过改造向导RNA序列,与转录激活子PUFa-P65-HSF1结合,实现高效靶向激活肝细胞内源基因直接重编程为胰岛样细胞。方法:采用脂质体转染法将Casilio体系(PNM)转染至HEK293T细胞系,靶向激活肝细胞内源PNM(Pdx1,Ngn3及MafA)基因,利用实时荧光定量PCR及免疫荧光检测内源PNM的表达。利用携带Ins-promoter-EGFP的慢病毒构建增强型绿色荧光蛋白稳定表达的Ins-EGFP HepG2细胞系,PiggyBac(PB)转座系统在此细胞系中构建核酸内切酶失活的Cas9(dCas9)和PUFa-P65-HSF1稳定表达的稳转细胞系。用脂质体向稳转细胞系分别转染针对PNM的向导RNA,然后实时荧光定量PCR和免疫荧光检测内源基因PNM的表达水平,并观察重编程效率。结果与结论:①实验在293T细胞系中验证了Casilio体系对内源基因的激活作用;②RT-PCR、Western Blot及免疫荧光检测验证了稳转细胞系中EGFP、dCas9和PUFa-P65-HSF1的表达;③实时荧光定量PCR证实靶向激活PNM的新型Casilio体系可实现内源PNM基因表达明显上调,直接重编程效率为10%-15%;④上述数据说明基于CRISPR/dCas9的新型Casilio体系,可成功激活肝脏内源PNM基因,可初步实现肝细胞系直接重编程为胰岛样细胞。
- 王晗月李富荣杨晓菲杨晓菲
- 关键词：体细胞胰岛样细胞
- 利用piggyBac转座子构建小鼠诱导性多能干细胞及其鉴定
- 2016年
- 目的:利用piggyBac转座子载体携带鼠源Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc 4个核转录因子,重编程胎鼠成纤维细胞(MEFs)为诱导性多能干细胞(iPSCs),并探讨其作用效果。方法:分离Oct4-GFP小鼠的MEFs,将携带鼠源Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc等4个基因的piggyBac转座子转入至MEFs;观察iPSCs克隆形成过程的形态表现;分析iPSCs染色体组成,评价iPSCs的核型变化。RT-PCR法检测小鼠iPSCs中胚胎干细胞(ESCs)相关基因Oct4、Nanog和FGF4的表达;免疫荧光、碱性磷酸酶染色和流式细胞术检测小鼠iPSCs中SSEA-1和Nanog蛋白表达。将iPSCs接种到NOD-SCID小鼠腹股沟进行畸胎瘤实验,4周后取畸胎瘤制备组织切片进行HE染色,观察组织分化情况。结果:通过piggyBac转座子成功构建iPSCs,其具有正常的核型,形态与小鼠ESCs相似,克隆边界清晰、呈圆形或卵圆形,克隆内细胞致密、核大。RT-PCR和免疫荧光染色分析,iPSCs可表达多能性基因和蛋白(Oct4、Sox2、Kif4和c-Myc)。在免疫缺陷小鼠体内接种iPSCs可形成具有3个胚层组织的畸胎瘤。结论:以piggyBac转座子为载体将Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc 4个转录因子基因导入MEFs,可以成功诱导MEFs成为具有ESCs特征的正常核型iPSCs。
- 任丽伟魏培杨晓菲杨璐邓春艳齐晖李富荣
- 关键词：PIGGYBAC重编程诱导性多能干细胞
- 细胞直接重编程——治疗糖尿病的新技术被引量：2
- 2014年
- 糖尿病是一类伴有不同程度胰岛素分泌缺乏或胰岛功能障碍的代谢性疾病。已成为继心血管病和肿瘤之后严重危害人类健康的第三大慢性疾病和全球第五大致死疾病。其目前的治疗方法主要是长期服用药物和注射胰岛素,没有根治手段。糖尿病患者的血管、神经等长期受血糖水平波动变化的影响产生一系列的病理变化,其中发病率最高的并发症为白内障、神经系统病变和背景性视网膜病变,给众多患者的生活、工作带来极大的困扰,
- 任丽伟杨晓菲李富荣
- 关键词：糖尿病胰岛Β细胞
- 抑制LSD1对hiPSCs向定型内胚层分化的调控作用
- 2018年
- 目的:探讨抑制组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶1(LSD1)对人诱导性多能干细胞(hiPSCs)向定型内胚层(DE)分化的调控作用。方法:利用LSD1抑制剂或shRNA抑制LSD1表达,观察hiPSCs形态变化并检测LSD1活性水平,CCK-8方法检测细胞增殖活性,qPCR检测hiPSCs多能性基因及各胚层标志基因的表达,IP-WB方法检测LSD1调控靶基因的复合体模式,Ch IP-qPCR方法检测DE标志基因启动子区域组蛋白H3第4位赖氨酸二甲基化和三甲基化(H3K4me2/me3)及第9位赖氨酸乙酰化(H3K9ac)水平。结果:(1)抑制LSD1可显著下调hiPSCs多能性基因OCT4、Y染色体性别决定区域盒2(SOX2)及Nanog同源盒(NANOG)的表达水平(P <0. 05);显著上调外胚层标志基因β3-微管蛋白(TUBB3),DE标志基因Y染色体性别决定区域盒17(SOX17)和叉头盒A2(FOXA2),以及中胚层标志基因骨形态发生蛋白2(BMP2)的表达水平(P <0. 05);(2)当LSD1活性为正常水平的53. 4%时利于DE分化;(3) LSD1在hiPSCs核内与组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)及阻遏物元件1沉默转录因子辅阻遏物(CoREST)以复合体的形式调控靶基因;(4)抑制LSD1后,SOX17和FOXA2基因启动子区域LSD1与HDAC1结合水平均显著下降,同时H3K4me2/me3和H3K9ac富集水平显著提高(P <0. 01)。结论:LSD1通过调控DE分化关键基因启动子区域H3K4me和H3K9ac水平来影响hiPSCs向DE的分化能力。
- 周淑艳周淑艳李富荣闫红杰李阳杨晓菲
- 关键词：RNA干扰分化
- 人脐带间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的免疫原性变化被引量：5
- 2018年
- 背景:人脐带间充质干细胞具有低免疫原性,而人脐带间充质干细胞诱导分化的胰岛素分泌细胞是否保持低免疫原性尚不清楚。目的:探讨人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞诱导分化后在体外的免疫原性变化及移植到宿主后微环境对免疫原性的影响。方法:(1)采用经典改良方案诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞,流式细胞术检测胰岛素分泌细胞免疫表型及细胞毒性实验中胰岛素分泌细胞的凋亡率;(2)CCK-8检测单向混合淋巴细胞实验中外周血单个核细胞的增殖能力;(3)小鼠腹腔及左肾包膜移植胰岛素分泌细胞后,流式细胞术及免疫组织化学检测移植部位的免疫细胞浸润情况。结果与结论:(1)人脐带间充质干细胞分化的胰岛素分泌细胞高表达HLA-ABC,低表达HLA-DR,CD40和CD80;(2)细胞毒性实验中胰岛素分泌细胞的凋亡率随预致敏脾细胞的增多而升高;(3)单向混合淋巴细胞实验中效靶比为10︰1,50︰1时胰岛素分泌细胞能抑制外周血单个核细胞增殖;(4)腹腔及左肾包膜移植胰岛素分泌细胞后移植部位淋巴细胞增多;(5)结果表明,人脐带间充质干细胞诱导分化的胰岛素分泌细胞在体外保持低免疫原性,但移植到体内后由于微环境的变化而具有一定免疫原性。
- 李兰兰李宁杨晓菲陈桃欧刚卫李富荣
- 关键词：人脐带间充质干细胞胰岛素分泌细胞诱导分化免疫原性干细胞国家自然科学基金
- 超声辐照在活体内直接重编程肝细胞治疗糖尿病的实验研究
- 目的：细胞直接重编程技术为糖尿病的治疗提供了新的途径。但目前主要通过逆转录病毒或腺病毒实现存在安全隐患。本研究拟通过超声辐照靶向微泡技术，将筛选出转录因子组合导入糖尿病小鼠肝脏，建立非病毒活体直接重编程技术，为糖尿病治疗...
- 杨晓菲任丽伟李阳李富荣
- 关键词：糖尿病肝细胞胰岛素分泌细胞
