张必超
- 作品数：10 被引量：5H指数：1
- 供职机构：新乡医学院生命科学技术系更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家级大学生创新创业训练计划博士科研启动基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 基于鸡胚电转技术研究脊髓神经干细胞相关基因功能方法的建立
- 2016年
- 目的建立一种基于鸡胚电转技术研究脊髓神经干细胞（NSCs）相关基因功能的方法。方法 RT-PCR检测鸡胚发育不同时期脊髓NSCs表面标志物;在鸡胚胚龄（E）E2.5~E3时,利用活体电转基因技术将p CAGGSGFP质粒转染到鸡胚脊髓,E6时体视荧光显微镜下筛选绿色荧光蛋白（GFP）阳性胚胎,每组至少取材5个;通过脊髓横切及open-book技术观察神经纤维投射情况;普通光学显微镜下剥离出3~5条脊髓,经胰蛋白酶消化、离心后,无血清NSCs培养基重悬获得细胞铺板,于37℃、5%CO_2细胞培养箱内培养,定时观察GFP阳性脊髓NSCs的形态变化。结果 RT-PCR结果表明,鸡胚脊髓中阳性表达NSCs表面标志物;随后的脊髓横切及open-book结果表明,GFP阳性转染侧的神经纤维能穿过底板,投射到脊髓对侧;而脊髓NSCs体外培养结果显示,GFP标记的脊髓细胞具有典型的NSCs形态,继续培养后有明显突起产生。结论本实验成功建立了一种基于鸡胚电转技术研究脊髓神经干细胞相关基因功能的方法。
- 于亚楠刘彦礼杨慈清张必超徐振平林俊堂
- 关键词：脊髓神经干细胞基因功能鸡胚
- 中枢神经系统发育过程Rap1影响神经元迁移的分子机制
- 中枢神经系统的发育是一个十分复杂的过程，尤其是大脑皮层的发育过程。在大脑皮层发育过程中，神经元迁移在其中扮演者重要的角色，神经元只有在正确的时间迁移到正确的位置，才能够形成正确的神经回路，进而发挥其相应的功能。神经元迁移...
- 张必超
- 关键词：中枢神经系统神经元迁移分子机制
- 原钙黏蛋白家族在中枢神经系统发育过程中的表达特点及功能
- 2015年
- 原钙黏蛋白(Pcdh)家族是钙黏蛋白超家族中最庞大的1个亚家族,在哺乳动物中,已发现有70多个家族成员。根据基因组结构的差异,Pcdh家族可分为成簇Pcdh(Pcdh-α、Pcdh-β和Pcdh-γ)和非成簇Pcdh(Pcdh-δ和solitary Pcdh)。Pcdh主要在中枢神经系统中表达,所以被认为在神经构筑及通路的形成过程中起重要作用,异常表达与一些神经类疾病的发生有关,因此具有十分重要的研究价值,但目前对其功能和机制知之甚少。本文总结了Pcdh在中枢神经系统的表达模式及其潜在的功能,为后续研究Pcdh在中枢神经系统的功能和机制提供基础信息。
- 张必超林俊堂
- 关键词：中枢神经系统
- 三种经典钙黏蛋白分子在鸡胚脊髓发育过程中的表达模式
- 2015年
- 目的：揭示神经钙黏蛋白、钙黏蛋白6与钙黏蛋白7在鸡胚脊髓发育过程中的时空表达模式。方法：取鸡胚正常发育过程 E3、E4、E5、E6、E8和 E10各时期的脊髓,原位杂交法检测神经钙黏蛋白、钙黏蛋白6与钙黏蛋白7在鸡胚脊髓发育过程中的时空表达模式。结果：在 E3~E6时期,神经钙黏蛋白主要在神经上皮层、生皮节、脊索、顶板、底板以及背根神经节区域表达,E8~E10时期,其 mRNA 信号主要在灰质区和背根神经节；在 E3~E5时期,钙黏蛋白6主要在生皮节、顶板和底板表达,之后在顶板和底板的表达均减弱,主要在侧运动柱表达；E3~E6时期,钙黏蛋白7主要在生皮节、底板、基板背部、运动柱、背根和腹根强烈表达,E8之后其表达主要集中在灰质区和腹根。结论：神经钙黏蛋白、钙黏蛋白6与钙黏蛋白7不同的表达模式预示着它们在脊髓及其周围组织发育过程中扮演不同角色。
- 李晗杨慈清乔梁张必超于亚楠林俊堂
- 关键词：原位杂交
- 不同Reelin基因型小鼠海马结构组织学差异被引量：1
- 2016年
- 目的通过对不同Reelin基因型小鼠海马区组织学结构的比较分析,为Reelin在海马结构形成中的作用提供依据。方法选择杂合子Reelin小鼠繁殖后代,在出生后10d进行基因型鉴定,设Reelin+/+、Reelin+/-和Reelin^-/-3组,每组3只小鼠。鉴定后的小鼠通过4%多聚甲醛心脏灌注后剥离全脑,通过多聚甲醛固定、蔗糖脱水后冷冻切片,采用4’6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)为细胞核染色,用免疫荧光标记T-box brain gene 1(Tbr-1)、神经元核抗原(Neu N)和GFAP特异性表达的细胞,光学显微镜下观察、摄片后对结果进行分析。结果从DAPI染色的细胞核及Tbr-1、Neu N和GFAP标记的细胞结构可以看出,Reelin+/+型小鼠和Reelin+/-型小鼠海马区都具有相似的结构,但将Reelin+/+和Reelin^-/-型小鼠相比较,Reelin^-/-型小鼠海马结构模糊,齿状回细胞向门区扩散,海马本部的细胞层结构紊乱,出现密集双细胞带,GFAP标记细胞减少。结论 Reelin缺失表达对小鼠大脑正常结构的形成具有明显的影响。在Reelin表达缺失后海马区齿状回细胞分布弥散,海马本部细胞层的分布紊乱,胶质细胞及纤维分布减少。
- 杨慈清李小英张必超郭潇周洁林俊堂
- 关键词：REELIN海马免疫荧光
- 鸡源Wnt3a融合蛋白表达载体的构建及其对鸡胚脊髓神经前体细胞增殖和轴突形成的影响
- 2017年
- 目的构建鸡源Wnt3a融合蛋白真核表达载体(pCAG-MCs-Wnt3a-EGFP),并探讨其在鸡胚脊髓发育过程中超表达后对神经前体细胞增殖及轴突形成的影响。方法利用分子生物学手段,提取鸡胚脊髓总RNA并获得Wnt3a片段,将其克隆到pCAG-MCs-EGFP载体中构建pCAG-MCs-Wnt3a-EGFP表达载体。在鸡胚发育至2.5~3d(E2.5~E3)时,利用鸡胚活体电转技术将pCAG-MCs-Wnt3a-EGFP(实验组)和pCAG-MCs-EGFP(对照组)质粒分别转入鸡胚脊髓,E4时取材切片,每组5个胚胎组织,采用免疫荧光染色技术检测Wnt3a和增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白表达变化分析Wnt3a与细胞增殖间的关系,根据载体自发绿色荧光蛋白(GFP)观察脊髓神经前体细胞轴突生成情况。结果 pCAG-MCs-Wnt3a-EGFP表达载体基因测序结果与Gene bank中基因序列一致,将pCAGMCs-Wnt3a-EGFP导入鸡胚脊髓中发现绿色荧光。在脊髓组织切片水平上,免疫荧光染色结果表明,Wnt3a在鸡胚脊髓中能够超表达。Wnt3a超表达后,与对照组比较,含有轴突的神经元数量明显减少(n=3,P<0.01),而PCNA的表达量显著增加(n=3,P<0.01)。结论成功构建了鸡源性Wnt3a融合蛋白真核表达载体,并证实Wnt3a在鸡胚发育过程中促进神经前体细胞的增殖并抑制轴突的形成。
- 李秋玲杨慈清张必超朱少义林俊堂
- 关键词：WNT3A增殖免疫荧光鸡胚
- 鸡胚发育过程中音猬因子超表达对Pax家族基因表达的影响
- 2015年
- 目的 探讨鸡胚发育过程中,音猬因子（Shh）基因在脊髓中超表达后对配对框（Pax）基因家族Pax3、Pax6以及Pax7蛋白表达的影响。方法 在鸡胚龄2.5-3.0d（E2.5-E3）时,实验组利用鸡胚脊髓活体电转基因技术将携带Shh基因的质粒和携带有绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的质粒共转入鸡胚脊髓,对照组则只转入报告基因质粒。E4时取材,每组至少取3例,冷冻切片后采用原位杂交技术检测Shh基因的mRNA表达水平,利用荧光免疫技术检测Shh在鸡胚脊髓中超表达后对Pax3,Pax6以及Pax7蛋白表达水平的影响,并将对照组及实验组中3种基因在脊髓两侧的表达量进行统计学分析。结果 原位杂交结果表明,E4时Shh的mRNA主要表达在脊髓底板和脊索,实验组结果显示,利用鸡胚脊髓活体电转技术成功建立了Shh超表达模型。对照组中荧光免疫结果表明,Pax3主要表达于脊髓翼板、生肌节、背根以及背根神经节;Pax6主要表达于跨越翼板和基板的脊髓中间部位;Pax7则主要均匀表达于翼板、顶板和生肌节。Shh超表达后,脊髓转染侧与未转染侧相比Pax3、Pax6以及Pax7的表达量差异极显著（P〈0.01）,这3种基因在脊髓中的表达均被抑制。结论 在鸡胚发育过程中,Pax家族Pax3、Pax6以及Pax7 3种基因在鸡胚脊髓中具有不同的表达模式,Shh超表达后对其均具有明显的抑制作用,显示这3种Pax基因受Shh信号通路调控。
- 李晗杨慈清乔梁张必超林俊堂
- 关键词：音猬因子原位杂交
- 一种自制电极鸡胚视顶盖转基因技术
- 2015年
- 目的建立一种高效鸡胚视顶盖电转基因技术,对自制电极进行评估。方法在鸡胚发育的第5天（E5）,将0.5 g/L的p CAGGS-绿色荧光蛋白（GFP）质粒0.25～0.5μl准确地注射到视顶盖内,每组60个鸡胚,在电压18V、每次脉冲60ms、间隔100ms、电脉冲6次的条件下,以原装电极为对照,自制电极为实验组进行定时定位活体电转基因,电转后在E6~E12时观察胚胎成活率,取材后在体视荧光显微镜下观察报告基因GFP表达结果以此判断转染的效率。结果在鸡胚模型中,通过自制电极转染鸡胚视顶盖,24h后鸡胚成活率达到89%,在鸡胚发育到E12时存活率达到35%,与原装电极相比分别提高48.3%和600%个百分点。结论自制电极在鸡胚视顶盖电转过程对胚胎的损伤小,转染后胚胎成活率高,为鸡胚视顶盖电转基因提供一种高效的转染技术。
- 杨慈清李小英王聪睿李晗张必超林俊堂
- 关键词：视顶盖鸡胚
- 不同reelin基因型小鼠大脑皮层分布的差异被引量：1
- 2018年
- 目的:比较分析不同reelin基因型小鼠大脑皮层分布的差异,为reelin在小鼠大脑皮层形成过程中的作用研究提供依据;方法:选择reelin杂合子小鼠繁殖后代,在出生10d时进行基因型鉴定,设reelin^(+/+)、reelin^(+/-)和reelin^(-/-)3组。每组取3只小鼠,采用DAPI染色细胞核,用荧光免疫组化标记FoxP-1、Tbr-1、NeuN和GFAP特异性表达的细胞,显微镜下观察拍照后进行结果分析;结果:从DAPI染色的细胞核及FoxP1、Tbr1、NeuN和GFAP标记的细胞显示,3种不同基因型小鼠大脑皮层结构彼此都存在一定差异,reelin^(+/-)型与reelin^(+/+)型小鼠相比大脑皮层结构相似,但也存在一定差异,如被FoxP-1和Tbr-1标记的神经元在SVZ区reelin^(+/-)型比reelin^(+/+)型更多;但reelin^(-/-)型与reelin^(+/+)型小鼠相比,reelin^(-/-)型小鼠大脑皮层无明显层的结构,FoxP-1、Tbr-1、NeuN和GFAP标记的细胞分布在整个皮层;结论:Reelin表达的下调或缺失对小鼠大脑皮层正常结构的形成存在影响,在reelin缺失表达后小鼠大脑皮层的形成明显发生异常,不具有典型的分层结构。
- 李小英郭潇周洁钱瑶瑶张必超杨慈清
- 关键词：神经元小鼠
- 双色荧光示踪鸡胚脊髓两侧连合纤维投射研究方法的建立被引量：2
- 2016年
- 目的建立1种双色荧光示踪鸡胚脊髓两侧连合纤维投射的实验方法。方法鸡胚孵育至胚龄2.5-3d,通过鸡胚活体原位电转基因技术将携带有报告基因绿色荧光蛋白（GFP）的质粒（p CAGGS-GFP）准确注射到鸡胚脊髓腔,实现定时、定位活体电转基因。转染后继续孵育至6d,取GFP阳性表达的胚胎,部分做脊髓横向切片,部分利用open-book技术将脊髓展开观察连合纤维的发育情况,每组至少取3个标本。其后在脊髓非转染侧连合神经元所在之处,点状注射Di I乙醇溶液,封片后于4℃避光孵育3d,在荧光显微镜下观察脊髓连合纤维投射情况。结果脊髓横切及open-book结果显示,鸡胚脊髓GFP阳性转染侧的神经元轴突穿过底板投射到脊髓对侧;同时在open-book结果中还可观察到,转染侧轴突穿过底板后分别沿腹索和外侧索向头尾部投射;Di I标记的非转染侧连合神经元轴突也同样穿过底板投射到对侧,并在侧索白质内延伸。结论本实验成功建立了1种双色荧光示踪鸡胚脊髓两侧连合纤维投射的研究方法,为研究脊髓神经发育提供技术保障。
- 于亚楠刘彦礼杨慈清张必超徐振平林俊堂
- 关键词：胚胎脊髓DI
