赵文紧
- 作品数：9 被引量：7H指数：1
- 供职机构：南京军区南京总医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 过敏毒素C3a在肾小球足细胞中的分泌性表达试验被引量：1
- 2015年
- 目的建立过敏毒素C3a分泌性表达慢病毒体系和分泌性高表达过敏毒素C3a的足细胞株,为研究过敏毒素C3a对足细胞的作用创造条件。方法人工合成过敏素素C3a分泌性表达基因;以重组慢病毒为媒介,将过敏毒素C3a分泌性表达基因导入到人足细胞系(human podocytes,HPC);利用药物筛选和连续梯度稀释克隆法获得稳定整合有过敏毒素C3a转基因结构的HPC细胞株;利用实时定量PCR从mRNA水平、酶联免疫吸附测定方法从蛋白质水平对过敏毒素C3a的表达和分泌情况进行鉴定。结果成功建立了过敏毒素C3a分泌性表达慢病毒体系;获得了分泌性高表达过敏毒素C3a的人肾小球足细胞株。结论所建立的过敏毒素C3a分泌性表达慢病毒体系和分泌性高表达过敏毒素C3a的足细胞株,为进一步分析过敏毒素C3a对足细胞的作用创造了条件。
- 郑敬民尹广赵文紧
- 关键词：过敏毒素C3A分泌性表达
- 低表达C3aR人肾足细胞的构建及鉴定
- 2016年
- 目的前期的研究中发现过敏性毒素C3a受体(C3aR)在糖尿病肾病病中表达增加,但在糖尿病肾中的病理意义及其在肾组织足细胞中的生理作用尚不清楚,文中通过建立C3aR低表达的肾足细胞系(HPC-C3aRsiRNA),为研究C3aR在肾足细胞中的生理功能提供细胞模型。方法设计合成人C3aR小干扰RNA(C3aRsiRNA),将其克隆到慢病毒表达载体中,通过与包装质粒共转染293T细胞,包装成C3aRsiRNA慢病毒,利用C3aRsiRNA慢病毒感染人肾足细胞HPC,根据C3aRsiRNA慢病毒具有嘌呤霉素抗性基因的特点筛选稳定转染的人肾足细胞。通过荧光定量PCR分析稳定转染的足细胞C3aR的mRNA表达水平,Western blot和免疫组化染色分析稳定转染的肾足细胞C3aR蛋白水平,鉴定稳定转染C3aR低表达的肾足细胞系。结果荧光定量PCR结果显示,与HPC-C3aRsiRNA细胞C3aR的mRNA水平(0.26±0.04)比较,非转染HPC细胞(1.00±0.13)和阴性对照(1.07±0.16)显著升高(P<0.05)。免疫组化染色显示HPC-C3aRsiRNA细胞的C3aR蛋白水平显著降低。Western blot结果显示,与HPC-C3aRsiRNA C3aR蛋白表达(0.62±0.09)比较,正常HPC、阴性转染的HPC表达(1.00±0.08、1.00±0.22)显著升高(P<0.05)。结论成功构建了C3aR低表达的肾足细胞系,可为进一步了解C3aR在肾中的生理作用提供细胞模型。
- 赵文紧张志诚郑敬民
- 关键词：低表达转染
- C3aR慢病毒表达载体的构建及在肾小管上皮细胞中的转染实验被引量：2
- 2015年
- 目的前期研究发现C3aR在糖尿病肾病肾小管上皮细胞中表达上调,但其在糖尿病肾病中的病理意义未知,且有关肾组织C3aR的确切生理和病理意义亦仍不清楚。文中通过构建C3aR慢病毒表达载体和过表达C3aR的肾小管上皮细胞株,为探讨C3aR在肾组织小管上皮细胞中的确切生理和病理意义提供细胞模型。方法根据人C3aR mRNA序列合成人C3aR基因,将其克隆到慢病毒表达载体p Lenti6.3-MCS-IRES2-EGFP的多克隆位点,构建成C3aR慢病毒表达载体p Lenti6.3-C3aR-IRES2-EGFP;经测序验证正确后,用构建的慢病毒表达载体p Lenti6.3-C3aR-IRES2-EGFP和包装质粒共转染293T细胞,包装成C3aR表达重组慢病毒;以C3aR表达重组慢病毒感染人肾小管上皮细胞系HK2,经药物筛选得到杀稻瘟菌素抗性细胞克隆;经荧光定量PCR分析和细胞免疫化学分析,鉴定出稳定过表达C3aR的人肾小管上皮细胞株。结果 1对构建成的C3aR慢病毒表达载体p Lenti6.3-C3aR-IRES2-EGFP进行全序列测序验证显示序列完全正确。2以构建的C3aR慢病毒表达载体和包装质粒(p LP1、p LP2和p LP/VSVG)共转染293T细胞,48 h后收集细胞培养上清,得到了滴度约为5×108个/m L的慢病毒液。3成功进行了C3aR重组慢病毒对HK2细胞的转染,得到了稳定转染了C3aR重组慢病毒的HK2细胞株HK2-C3aR;基于荧光定量PCR和细胞免疫化学染色的分析证实HK2-C3aR细胞株中C3aR表达水平较HK2非转染对照细胞高(2.33±0.45 vs 1.00±0.09,P<0.05)。结论成功构建了C3aR慢病毒表达载体和过表达C3aR的人肾小管上皮细胞株,为进一步研究C3aR过表达在人肾小管上皮细胞中的病理意义提供了很好的细胞模型,也为进一步开展C3aR在其他细胞中的生理、病理意义创造了条件。
- 郑敬民尹广赵文紧刘志红
- 关键词：慢病毒肾小管上皮细胞过表达
- C3aR激动剂对小鼠原代肾小管上皮细胞表型的影响被引量：1
- 2017年
- 目的细胞转分化(EMT)过程中的关键事件包括上皮细胞蛋白(E-钙黏蛋白)的表达下调,细胞活动性增加,细胞基质生成的增多等。文中构建鼠原代肾小管上皮细胞培养及鉴定的方法,探究C3aR活化是否能够引起小管上皮细胞发生上皮-间质细胞转分化。方法用鼠肾小管节段进行肾小管上皮细胞原代培养,以免疫细胞化学及免疫荧光染色对上皮细胞进行鉴定。实验分为正常对照组,C3aR激动剂设5个浓度组:0.1、1、100、500及2000 ng/m L组,另设3个时间组:6、12及24 h组。利用Real-time PCR检测肾小管上皮细胞中E-钙黏蛋白、α-SMA及collagen I的表达水平变化;利用Western blot检测E-钙黏蛋白、α-SMA蛋白表达水平;用鬼笔环肽对上皮细胞行骨架染色,观察细胞骨架形态变化。结果与正常对照组比较,C3aR激动剂组(500 ng/m L、刺激48 h)抑制E-钙黏蛋白表达[(0.950±0.901)vs(0.650±0.221),P<0.05],上调α-SMA[(1.380±0.062)vs(1.600±0.103),P<0.05]和collagen I表达(P<0.05),且各自表达趋势与C3aR激动剂呈时间和剂量依赖关系。细胞骨架染色结果显示,随着C3aR激动剂刺激时间的延长,上皮细胞内由激动蛋白构成的应力纤维生成逐渐增多。结论成功构建了小鼠肾小管上皮细胞原代培养及鉴定的方法;C3aR活化能够促进肾小管上皮细胞发生上皮-间质细胞转分化,并在肾纤维化的发生发展中起一定作用,预示C3aR可能成为肾疾病治疗的新靶点。
- 张志诚赵文紧郑敬民
- 关键词：肾小管上皮细胞原代培养
- 缺氧通过HIF-1α/NF-κB通路诱导肾小管上皮细胞C3aR表达（英文）
- 2017年
- C3aR是补体C3a的受体.在肾脏,已发现C3aR表达于包括肾小管上皮细胞在内的多种细胞.在特定的病理情况下,C3aR表达上调并参与多种肾脏疾病的病理过程,但有关C3aR在肾脏细胞中的表达调控机制仍不清楚.小管间质缺氧是肾脏疾病中的一种常见现象,也是一种重要致病因素.为了探讨缺氧对C3aR的表达调控作用,本文利用体外缺氧模型,对模型条件下C3aR在肾小管上皮细胞中的表达变化情况进行了分析,同时检测了HIF-1α和NF-κB的表达变化及活化情况,以及HIF-1α和NF-κB抑制剂对C3aR的表达影响情况.结果发现缺氧可诱导C3aR mRNA及蛋白质水平的表达上调、HIF-1α和NF-κB的核转移.HIF-1α和NF-κB抑制剂可阻断缺氧对C3aR的诱导作用,且HIF-1α抑制剂可抑制NF-κB的核转移.这些结果说明缺氧可通过HIF-1α/NF-κB通路诱导肾小管上皮细胞C3aR的表达.考虑到C3aR活化可促进肾小管的损伤,我们推测C3aR通路可能参与了缺氧和NF-κB诱导的肾小管损伤过程,可能是防治缺氧和NF-κB诱导肾组织损伤的一个新靶标.
- 赵文紧陈德君李丽娟郑敬民
- 关键词：缺氧HIF-1ΑNF-ΚB
- 过表达C3aR人足细胞的构建及鉴定
- 2014年
- 目的构建过表达C3a受体(C3aR)的肾小球足细胞株,为探讨C3aR在肾小球足细胞中的确切生理和病理意义提供细胞模型。方法设计合成人C3aR表达单元,将其克隆到慢病毒表达载体p Lenti6.3-MCS-IRES2-EGFP的多克隆位点,构建成C3aR表达载体p Lenti6.3-C3aR-IRES2-EGFP;将p Lenti6.3-C3aR-IRES2-EGFP和包装质粒共转染293 T细胞,包装成C3aR表达重组慢病毒LV-C3aR;以LV-C3aR感染人肾小球足细胞系HPC,根据LV-C3aR上带有杀稻瘟菌素抗性基因的特点,以杀稻瘟菌素筛选稳定转染细胞克隆;利用荧光定量PCR和细胞免疫化学分析方法对稳定转染细胞克隆的C3aR表达水平进行分析,从中鉴定出稳定过表达C3aR的人肾小球足细胞株。结果成功构建了C3aR表达载体p Lenti6.3-C3aR-IRES2-EGFP;得到了高滴度的C3aR表达重组慢病毒LV-C3aR;成功构建了过表达C3aR的人肾小球足细胞株HPC-C3aR。结论成功构建C3aR表达载体和过表达C3aR的人肾小球足细胞株,为进一步研究C3aR过表达在人肾小球足细胞中的病理意义提供了很好的细胞模型,也为进一步开展C3aR在其他细胞中的生理、病理意义创造了条件。
- 郑敬民尹广赵文紧刘志红
- 关键词：慢病毒肾小球足细胞过表达
- C3aR过度活化与糖尿病肾病肾组织损伤的关系被引量：1
- 2018年
- C3aR是补体C3裂解产物C3a的受体.最近的一些研究提示C3aR通路可能参与了糖尿病肾病(DN)的病理过程,但有关C3aR通路在DN中的确切病理作用及有关机制远未清楚.需要特别指出的是,现有的有关C3aR参与DN肾组织损伤的证据主要来自一些动物模型的研究,临床上尚缺乏较为系统全面的对DN患者肾组织C3aR通路与肾组织损伤关系的观察分析.为此,本文首次以较大的样本量分析了不同病理时期DN患者肾组织C3aR和C3a的表达变化情况及其与DN患者肾组织损伤的相关性.在此基础上,进而利用体外细胞模型,对高糖环境下C3aR活化致肾小球足细胞损伤的作用及机制进行了探讨.结果显示:a.与正常对照组相比,DN患者肾组织C3a和C3aR的表达水平随DN的进展而升高,C3aR在DN患者肾组织中的表达上调主要见于肾小管上皮细胞和肾小球足细胞;b.DN患者肾组织C3aR和C3a水平与患者肾组织损伤程度,特别是小管和小管间质损伤程度、肾小球足细胞损伤程度具有显著相关性;c.外加C3a激活C3aR可使高糖环境中的足细胞的细胞骨架发生明显改变、足细胞标记分子表达下调、足细胞通透性增加.这些结果说明:a.DN患者肾组织中确实存在C3a/C3aR轴过度活化的现象;b.C3a/C3aR轴的过度活化很可能在DN患者肾组织损伤,特别是小管和小管间质损伤、肾小球足细胞损伤中具有重要作用;c.可能通过破坏成熟足细胞特有的细胞骨架,改变足细胞标记分子表达,增加足细胞的通透性,C3a/C3aR轴过度活化参与DN足细胞损伤过程.本文不仅为C3a/C3aR通路参与DN病理过程提供了新的必不可少的临床证据,也增加了对C3a/C3aR通路过度活化致DN患者肾组织损伤机制,特别是肾小球足细胞损伤机制的了解,这对于拓展对DN病理机制的认识,发展DN防治新思路,无疑都是有益的.
- 郑敬民陈德君尹广赵文紧李丽娟王建平
- 关键词：C3A糖尿病肾病足细胞病理意义
- 炎性细胞因子对人肾小管上皮细胞C3a受体表达的调控被引量：1
- 2016年
- 目的:为更好了解肾脏组织中C3aR表达调控因素,我们研究了多种炎性细胞因子对人肾小管上皮细胞(HK2细胞)C3a受体(C3aR)表达的调控作用。方法:用多种炎性细胞因子[干扰素γ(IFN-γ)、C3a、白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、转化生长因子β(TGF-β)]刺激HK2细胞,利用荧光定量PCR、免疫组化及免疫印迹的方法检测HK2细胞C3aR表达水平。结果:炎性细胞因子IFN-γ能够显著促进HK2细胞C3aR的表达上调[与正常对照组相比,C3aR mRNA表达水平的约增长5倍(P=0.001),蛋白水平表达上调大约1.6倍(P=0.046)],且HK2细胞C3aR mRNA水平表达上调与IFN-γ呈剂量及时间依赖关系;而其他的炎性细胞因子如TNF-α、TGF-β、IL-1β甚至生物活性多肽C3a均未观察到对HK2细胞C3aR表达造成影响。结论:肾小管上皮细胞表面可表达生物活性肽段C3aR,而且炎症细胞因子IFN-γ能够明显增强肾小管上皮细胞C3aR表达,预示C3a/C3aR轴可能参与了肾脏局部炎症反应的调节并且与肾脏疾病的发生、发展有一定的相关性。
- 张志诚赵文紧刘志红郑敬民
- 关键词：炎症细胞因子干扰素Γ肾小管上皮细胞
- C3a分泌性表达载体及过表达C3a肾小管上皮细胞株的构建被引量：1
- 2015年
- 目的已有的研究表明包括糖尿病肾病在内的多种肾病患者肾小管上皮细胞存在C3a/C3aR轴过度活化现象,但有关C3a/C3aR轴过度活化在肾小管上皮细胞中的病理意义未知。文中构建分泌性过表达C3a的肾小肾小管上皮细胞株,为探讨各种病理情况下C3a/C3aR轴过度活化的病理意义提供细胞模型。方法设计合成人C3a分泌性表达单元,将其克隆到慢病毒表达载体p Lenti6.3-MCS-IRES2-EGFP的多克隆位点,构建成C3a分泌性表达载体p Lenti6.3-C3a-IRES2-EGFP;将p Lenti6.3-C3a-IRES2-EGFP和包装质粒共转染293 T细胞,包装成C3a表达重组慢病毒LV-C3a;以LV-C3a感染人肾小管上皮细胞系HK2,根据LV-C3a上带有杀稻瘟菌素抗性基因的特点,以杀稻瘟菌素筛选稳定转染细胞克隆;利用荧光定量PCR和ELISA方法对稳定转染细胞克隆的C3a表达水平和分泌情况进行分析,从中鉴定出稳定分泌性过表达C3a的人肾小管上皮细胞株。结果 1成功构建了序列完全正确的C3a分泌性表达载体p Lenti6.3-C3a-IRES2-EGFP;2成功进行了重组慢病毒包装,得到了高滴度(5×108个/m L)的C3a表达重组慢病毒LV-C3a;3成功进行了LV-C3a对HK2细胞的转染,得到了稳定转染LV-C3a的HK2细胞株;基于荧光定量PCR和ELISA的分析证实,与HK2细胞比较,HK2-C3a细胞株中C3a mRNA表达水平显著升高[(1.0±0.5)vs(1 321.0±18.0),P<0.01],分泌的C3a水平显著升高[(0.3±0.2)ng/m L vs(249.0±37.0)ng/m L,P<0.01]。结论成功构建的C3a分泌性慢病毒表达载体和分泌性过表达C3a的人肾小管上皮细胞株为进一步研究各种病理情景中C3a/C3aR过度活化在人肾小管上皮细胞中的病理意义提供了很好的细胞模型,也为进一步开展C3a/C3aR过度活化在其他细胞中的病理意义创造了条件。
- 郑敬民尹广恽时锋赵文紧
- 关键词：C3A慢病毒肾小管上皮细胞过表达
