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NDPK C4S突变体构建表达及活性测定: ＜正＞引言:NDPK-A 是一种多能蛋白,但其多能性的物质基础迄今尚未阐明,本研究通过过定点突变研究二硫键异构对 NDPK-A 酶活性方面的影响,并阐明 NDPK 结构与功能之间的对应关系。方法:利用聚合酶链反应（PCR...; 高相雷熊盛郭朝万; 文献传递

中试规模高效纯化重组人核苷二磷酸激酶A: 2007年; 中试规模纯化重组人核苷二磷酸激酶A(rhNDPK-A)。菌体高压匀浆,然后微滤去除菌体碎片,超滤浓缩,所得样品上样DEAE-sepharose Fast Flow,收集目的峰,上样Cibacron Blue 3GA Sepharose CL-4B,含ATP的缓冲液洗脱目的蛋白,超滤精制。结果表明,1500g菌体经过2次匀浆后,所得匀浆液中含NDPK47.6g,经过微滤超滤处理后,可回收目的蛋白27.3g。再经过两步柱层析及超滤精制后,最终可得纯度为96.3%的目的蛋白17.2g,总回收率为36.2%,每100g湿菌体的蛋白产率为1.15g。比较每个步骤的回收率,发现精制>亲和层析>离子交换层析>样品前处理过程。与前期报道发酵工艺联用,rhNDPK-A的纯化产量达到510mg/L。工艺简便、得率高的rhNDPK-A纯化工艺的建立为NDPK的应用开发提供了物质基础;另外,本文结果也提示,对于非分泌型重组蛋白来说,影响目的蛋白回收的最主要因素可能不是柱层析,而是样品前处理过程。; 熊盛钱垂文郭朝万黄立刘秋英张美英王一飞; 关键词：核苷二磷酸激酶纯化超滤

人核苷二磷酸激酶A异构体的构建与生物活性初步研究: 目的：利用生物学方法制备稳定存在的四种人二磷酸核苷激酶A亚基(NDPK-A)氧化还原异构体，确定造成NDPK-A二硫键异构的关键残基，研究NDPK-A氧化还原异构体在磷酸基转移酶活性、DNase酶活性、抑癌活性上的差异。...; 郭朝万; 关键词：NM23-H1 核苷二磷酸激酶纯化酶活性; 文献传递

nm23-H1基因实时荧光定量PCR标准质粒的构建: 2007年; 目的:制备用于nm23-H1基因mRNA实时荧光定量PCR检测的质粒标准品。方法:通过PCR扩增出目的片断,纯化后T-A连接至pMD18-T载体,转化宿主菌E.coliDH5α,获得阳性克隆;通过PCR扩增、双酶切鉴定和测序分析,确认重组质粒完整正确;大量抽提重组质粒,测定其拷贝浓度,10倍稀释成梯度标准品,并进行荧光定量PCR检测分析。结果:nm23-H1基因目的片段成功重组至pMD18-T载体上,获得的重组质粒保持了目的片段的特异性和序列完整性。梯度浓度标准质粒的荧光定量PCR结果显示,循环阈值(C t)与起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系。结论:成功构建了nm23-H1基因实时荧光定量PCR质粒标准品。; 张传海刘秋英金琳刘格郭朝万张美英王一飞; 关键词：实时荧光定量PCR 重组质粒标准品

核苷二磷酸激酶A的定点突变及C4S突变体的制备和活性研究被引量：1: 2010年; 目的:对核苷二磷酸激酶A(NDPK-A)二硫键异构的关键残基C4进行定点突变,构建、表达并纯化C4S突变体,测定其磷酸转移酶活性和DNase活性,研究二硫键异构对NDPK-A活性的影响。方法:以pBV220-nm23-H1质粒作为模板,通过设计合适的引物对NDPK-A进行定点突变,将第4位半胱氨酸突变为丝氨酸,构建NDPK-AC4S突变体;在大肠杆菌BL21中表达,DEAE-sepharose Fas tFlow与Cibacron Blue 3GA Sepharose CL-4B纯化目的蛋白,获得均一重组蛋白,纯度达到98%;DNA序列测定及重组蛋白的肽质量指纹图谱(PMF)分析均证明构建正确突变体;高效液相色谱法(HPLC)与DNA消化法分别测定野生型NDPK-A与C4S突变体的磷酸转移酶活性与DNase活性差异。结果:NDPK-AC4S突变体的磷酸基转移酶与DNase酶活性均高于野生型NDPK-A。结论:NDPK-A缺失二硫键后,活性增高。NDPK-A形成链内二硫键可能是其活性负调控模式之一。; 陈蕴如郭朝万黄增委钱垂文张晓伟王一飞熊盛; 关键词：定点突变二硫键

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郭朝万