蒋凯
- 作品数：11 被引量：22H指数：3
- 供职机构：军事医学科学院生物工程研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金北京市自然科学基金军队杰出人才基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 人Egr-1启动子的克隆及其在肿瘤细胞中的辐射诱导反应被引量：3
- 2009年
- 目的:克隆人Egr-1基因的启动子,插入荧光素酶报告基因载体中,并检测电离辐射对其活性的影响。方法:采用PCR技术从人乳腺癌细胞系MCF-7基因组中扩增出Egr-1启动子,将其克隆到pGL3-basic载体中;将重组质粒转染人肿瘤细胞,测定Egr-1启动子在不同辐射条件下转录活性的改变。结果:成功构建了Egr-1启动子的荧光素酶报告基因;在不同剂量的γ射线照射后,Egr-1的启动子活性均明显高于未照射组;在同一剂量照射后48 h,Egr-1的启动子活性达峰值。结论:本实验构建的Egr-1启动子具有辐射激活的功能,为进一步研究放射-基因治疗奠定了基础。
- 徐小洁丁丽华王凌雪秦玺程龙蒋凯叶棋浓
- 关键词：EGR-1启动子启动子活性
- 运用新型的反向PCR策略高效构建基因的点突变体被引量：4
- 2011年
- 基因的点突变体在其结构和功能研究中发挥非常关键的作用,如何高效、经济地构建基因点突变体是许多分子生物学研究遇到的棘手问题.以PIAS3点突变体的构建为对象,设计了新型的以反向PCR为基础的点突变构建流程,获得的点突变体质粒经测序后均与预期相符,并在293T细胞内得到了正确表达.以上结果表明,该实验设计方案能够高效、方便地用于基因点突变体的构建,为进一步研究它们的分子功能打下了基础.
- 程龙韩白玉侯莎韩永健徐小洁蒋凯李法曾杨智洪窦京涛吕朝晖张浩叶棋浓
- 关键词：反向PCRPIAS3点突变
- siRNA抑制ErbB2基因的表达及对乳腺癌细胞生长的影响被引量：4
- 2011年
- 目的:设计并构建ErbB2的小干扰RNA,检测其对ErbB2蛋白表达的干扰效果,并检测其对乳腺癌细胞ZR75-1生长的影响。方法:设计2条针对ErbB2的siRNA,并克隆到siRNA表达载体pSliencer 2.1-U6 neo上。经酶切和测序证明构建成功后,将其与pcDNA3-FLAG-ErbB2共转染于293T细胞,以及单转siRNA于乳腺癌SKBR3和ZR75-1细胞,通过Western blot分别检测siRNA对外源和内源ErbB2的干扰效果。通过结晶紫实验研究siRNA对ZR75-1生长的影响。结果:Western blot证明构建的两条ErbB2 siRNA均能有效抑制外源和内源ErbB2蛋白的表达,并抑制乳腺癌ZR75-1细胞的生长。结论:构建的siRNA能有效地抑制ErbB2蛋白的表达并抑制ZR75-1细胞的生长。
- 蒋凯杨智洪王朝云徐小洁程龙张浩韩永健叶棋浓
- 关键词：ERBB2SIRNA乳腺癌细胞生长
- 动物活体成像生物发光稳定细胞株的构建被引量：2
- 2011年
- 目的:构建组成型表达萤光素酶基因的载体,建立稳定高表达萤光素酶的MCF-7乳腺癌细胞株,检测其对细胞增殖的影响及在传代后的表达效果。方法:以载体pGL4.20为模板,PCR扩增萤火虫萤光素酶基因,将其克隆到载体pIRESpuro2上,将获得的pIRESpuro2-Luc经酶切和测序验证后,转染293T、MCF-7及ZR75-1细胞,通过检测萤光素酶报告基因的活性,检测其表达效果;将萤光素酶基因表达载体转染MCF-7细胞,通过嘌呤霉素筛选稳定转染细胞株,用有限稀释法挑选高表达萤光素酶基因的单克隆细胞株,并检测其对细胞增殖的影响与传代后的表达效果。结果:测序结果表明构建了萤光素酶基因表达载体,活性测定证明了其表达效果;筛选到高表达萤光素酶基因的MCF-7稳定转染细胞株,分析表明其遗传稳定性良好,对细胞的增殖没有影响。结论:构建了高表达萤光素酶基因的MCF-7稳定转染细胞株。
- 蒋凯韩永健程龙徐小洁张浩曹佳范忠义叶棋浓
- 关键词：萤光素酶活体成像生物发光乳腺癌
- 雌激素信号通路调节蛋白的发现及其在肿瘤中的作用
- 叶棋浓程龙徐小洁丁丽华蔺静袁斌牛畅王晓辉严景华张浩秦玺李杰萍杨智洪蒋凯熊志红
- 肿瘤是威胁人类健康的重大疾病，雌激素信号通路的失调是导致乳腺癌、肝癌、肺癌等诸多恶性肿瘤发生发展的重要原因之一。雌激素通过结合雌激素受体（ER）发挥生理和病理功能。因此，阐明雌激素信号通路的调节机制，发现新的雌激素信号通...
- 关键词：
- 关键词：调节蛋白肿瘤治疗
- PES1慢病毒表达载体的构建及其对乳腺癌ZR75-30细胞生长的影响
- 2011年
- 目的:利用慢病毒载体表达PES1基因,研究其对乳腺癌ZR75-30细胞生长的影响。方法:以乳腺文库为模板,PCR扩增PES1基因,克隆到pCDH载体,构建成pCDH-PES1,将其与包装载体共转293T细胞,包装成Lenti-PES1慢病毒载体并测定病毒滴度,感染乳腺癌ZR75-30细胞,Western印迹鉴定病毒载体介导的PES1蛋白的表达,并用生长曲线实验研究过量表达PES1对ZR75-30细胞生长的影响。结果:酶切和Western印迹表明得到pCDH-PES1阳性克隆,成功包装成Lenti-PES1慢病毒载体,滴度为2.5×107 pfu/mL;将此慢病毒载体感染ZR75-30细胞,Western印迹显示慢病毒载体成功表达PES1,生长曲线实验表明过量表达PES1可促进ZR75-30细胞的生长。结论:构建了PES1的慢病毒表达载体Lenti-PES1,在ZR75-30细胞中过量表达PES1可促进细胞的生长。
- 程龙韩永健蒋凯曹佳张浩徐小洁朱建华杨智洪叶棋浓
- 关键词：慢病毒载体乳腺癌细胞生长
- 人GST-Cdc25C融合蛋白的原核表达、纯化及功能初步检测被引量：5
- 2012年
- 目的:构建人Cdc25C基因原核表达载体,获得纯化的GST-Cdc25C融合蛋白,并对其功能进行初步检测。方法:用PCR方法从乳腺文库中扩增Cdc25C基因编码序列,将其正确插入pGEX-KG载体,重组质粒转化大肠杆菌Ros-sate表达后,用GST-Sepharose 4B珠子纯化融合蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot方法检测融合蛋白表达,通过GSTpull-down技术检测纯化蛋白与已知结合蛋白Chk2的相互作用。结果:构建得到Cdc25C基因的原核表达载体,双酶切鉴定得到与预期片段大小相符的外源基因插入片段,经测序与目的序列完全一致;在Rossate菌中诱导表达出相对分子质量(Mr)约为80 000的目的蛋白,经SDS-PAGE和Western blot检测,融合蛋白成功表达,并纯化得到GST-Cdc25C融合蛋白,GST pull-down检测证实GST-Cdc25C蛋白可以和已知相互作用蛋白Chk2相互作用。结论:成功克隆Cdc25C基因,并获得了活性良好的GST-Cdc25C蛋白,为进一步研究细胞周期蛋白调控机制奠定了实验基础。
- 范忠义徐小洁曹佳康磊韩白玉蒋凯叶棋浓杜楠
- 关键词：原核表达纯化
- 核心组蛋白的融合表达和纯化
- 2011年
- 目的:克隆核心组蛋白H2A、H2B、H3和H4的基因,表达并纯化组蛋白与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。方法:用PCR方法从乳腺文库中扩增核心组蛋白H2A、H2B、H3和H4的编码序列,分别将其以正确相位与pGEX-KG载体中的GST编码序列融合,得到重组质粒pGST-H2A、pGST-H2B、pGST-H3和pGST-H4,分别转化大肠杆菌BL21,表达融合蛋白GST-H2A、GST-H2B、GST-H3和GST-H4;用谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和纯化融合蛋白;用Western印迹检测融合蛋白的表达及纯化。结果:分别构建了核心组蛋白H2A、H2B、H3和H4的融合表达载体;Western印迹检测表明,融合蛋白GST-H2A、GST-H2B、GST-H3和GST-H4获得表达及纯化。结论:表达并纯化了H2A、H2B、H3和H4的融合蛋白,为进一步研究核心组蛋白的功能奠定了基础。
- 曹佳丁丽华范忠义程龙蒋凯徐晓洁韩永健徐承水叶棋浓
- 关键词：组蛋白克隆融合蛋白
- PES1基因小干扰RNA慢病毒载体的构建及其对乳腺癌ZR75-30细胞的生长抑制
- 2011年
- 目的:构建PES1基因的慢病毒干扰载体,研究其对乳腺癌细胞ZR75-30生长的影响。方法:设计针对PES1基因的siRNA引物,克隆到pSIH1-H1-Puro载体,包装成慢病毒,测定病毒的滴度,感染人乳腺癌细胞ZR75-30,通过Real-time PCR和Western印迹检测干扰效果,并通过生长曲线研究敲低PES1对ZR75-30细胞生长的影响。结果和结论:构建了具有明显干扰效果的PES1基因的siRNA慢病毒载体,能够有效抑制ZR75-30细胞内源的PES1 mRNA和蛋白水平,敲低PES1能够抑制ZR75-30细胞的生长。
- 程龙张浩韩永健蒋凯徐小洁朱建华杨智洪叶棋浓
- 关键词：慢病毒载体
- SUMO-2/3与孕激素受体的共价结合及其对该受体转录活性的调节被引量：2
- 2011年
- 目的研究B型孕激素受体(progesterone receptor B type;PRB)是否能被SUMO-2、SUMO-3类泛素化修饰,并探讨这种修饰对孕激素受体转录活性的影响。方法以人的MCF-7 cDNA为模板进行PCR反应,扩增出SUMO-2、SUMO-3的cDNA,构建真核表达载体pcDNA3FLAG-SUMO2与pcDNA3FLAG-SUMO3;将质粒pXJ40-myc-PRB分别与pcDNA3-FLAG、pcDNA3FLAG-SUMO2、pcDNA3FLAG-SUMO3共转染人胚肾细胞293T,运用免疫共沉淀及western印迹的方法检测其是否发生类泛素化修饰;运用测定荧光素酶报告基因的方法检测类泛素化修饰对孕激素受体转录活性的影响。结果构建成功表达载体pcDNA3FLAG-SUMO2与pcDNA3FLAG-SUMO3;免疫共沉淀实验证实sumo2/3均可以与PRB共价结合;SUMO-2、SUMO-3能以孕激素依赖的方式增强PRB的转录活性。结论 SUMO-2、SUMO-3分子能够对孕激素受体PRB进行类泛素化修饰,并调节其分子功能。
- 韩白玉李法曾程龙徐小洁蒋凯付洁韩永健吕朝晖窦京涛张浩叶棋浓
- 关键词：PRB转录活性
