罗维玉
- 作品数：13 被引量：32H指数：4
- 供职机构：甘肃农业大学动物医学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划中央级公益性科研院所基本科研业务费专项更多>>
- 相关领域：农业科学生物学医药卫生更多>>
- 应用酵母双杂交系统筛选与流感病毒NS2蛋白相互作用的宿主蛋白被引量：2
- 2015年
- 流感病毒的NS2蛋白能够介导病毒核糖核蛋白复合体(v RNP)的核输出过程,而且可以调控病毒聚合酶的活性,参与禽流感病毒在哺乳动物宿主体内的适应过程。为鉴定与NS2相互作用的宿主蛋白,本研究利用流感病毒NS2蛋白作为"诱饵"蛋白,通过经典酵母双杂交系统筛选与其相互作用的宿主蛋白,并利用免疫共沉淀(Co-IP)和GST pull-down方法进一步验证其相互作用关系。结果表明,通过酵母双杂交系统筛选含有Calu-3、A549、THP-1和U251 4种细胞的c DNA文库,共筛选到7种蛋白,分别为HGS、EXOSC4、ZWINT、PRDX3、IRF3、NDUFB9和RMND5B,根据Gene Ontology分析结果表明,这些蛋白分别参与细胞生长发育、细胞代谢和细胞定位等过程。其中对过氧化物氧还酶3(PRDX3)进行了Co-IP和GST pull-down试验证实重组表达的NS2蛋白和PRDX3蛋白在293T细胞中存在特异性的相互作用。本研究为进一步研究两者之间相互作用如何影响NS2蛋白功能以及病毒的复制周期奠定了基础。
- 邵信媛朱鹏阳罗维玉赵玉辉梁立滨姜丽陈化兰胡永浩李克生李呈军
- 关键词：禽流感病毒酵母双杂交免疫共沉淀宿主蛋白
- H6N6亚型禽流感病毒反向遗传操作系统的建立被引量：2
- 2013年
- 为建立H6N6亚型禽流感病毒(AIV)A/Chicken/GuangDong/S1311/10(W-CKGD)反向遗传操作系统,本研究构建了W-CKGD的8个重组质粒,拯救出AIV A/Chicken/GuangDong/S1311/10(R-CKGD)。全基因序列测定结果表明,救获病毒R-CKGD与野生病毒W-CKGD的核苷酸序列完全相同。R-CKGD与W-CKGD具有相同的受体结合特性和对BALB/c小鼠均呈低致病性,以106EID50剂量鼻腔感染BALB/c小鼠,病毒仅在小鼠的呼吸道复制,可以引起小鼠体重下降但均不造成死亡。实验结果表明,R-CKGD与W-CKGD保持了一致的生物学特性,从而为进一步研究H6亚型AIV的致病机理及跨宿主传播机制等提供了良好的平台。
- 张国权王国俊罗维玉姜永萍施建忠邓国华田石杨孝朴陈化兰
- 关键词：禽流感病毒
- 流感病毒NP蛋白与宿主蛋白SNRPA的相互作用研究被引量：4
- 2017年
- 流感病毒核蛋白(NP)是由病毒RNA节段5编码的主要结构蛋白,与病毒基因组RNA及聚合酶(PB1、PB2、PA)构成核糖核蛋白(vRNP)复合体,是病毒基因组的转录和复制的基本功能单位。本实验室采用酵母双杂交技术从人细胞系cDNA文库中筛选与流感病毒NP蛋白相互作用的宿主蛋白U1 small nuclear ribonucleoprotein A(SNRPA)。本研究通过酵母回交验证、免疫共沉淀(Co-IP)和GST pull down试验进一步证实NP与SNRPA之间存在直接相互作用。利用siRNA干扰基因的表达后,流感病毒的复制滴度在24 h和48 h分别下降2.7倍和1.75倍,表明SNRPA蛋白表达对流感病毒的复制发挥正调控作用。本研究丰富了流感病毒蛋白与宿主蛋白之间的蛋白质调控网络,为进一步研究流感病毒复制调控的机制奠定了基础。
- 张杰罗维玉周圆王广文赵玉辉周陈陈黄山雨李呈军陈化兰姜丽
- 关键词：酵母双杂交NP蛋白相互作用
- 蛋白激酶R的原核表达、纯化及多克隆抗体制备被引量：1
- 2016年
- 【目的】构建蛋白激酶R的原核表达系统并制备其多克隆抗体.【方法】利用RT-PCR方法从人的A549细胞中扩增蛋白激酶R(PKR)基因,将其克隆到表达载体pGEX-6P-1中,经纯化后制备特展异性多克隆抗体.【结果】PKR基因经测序鉴定后转化宿主菌BL21(DE3)感受态细胞,经终浓度0.5mmol/L IPTG诱导表达GST-PKR融合蛋白,SDS-PAGE分析表明融合蛋白获得稳定表达.表达产物经Glutathione-sepharose 4B亲和层析初步纯化后,用凝血酶切除GST标签,而后经离子交换层析及分子筛在AKTA Explorer上进一步纯化,得到高纯度无标签的PKR蛋白.以纯化后的PKR蛋白为抗原免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,斑点杂交试验检测其效价达到1∶50 000以上,Western-blot和间接免疫荧光试验(IFA)表明制备的多抗与PKR蛋白的反应具有高度特异性.【结论】PKR蛋白在大肠杆菌中成功表达,且制备的多克隆抗体可用于PKR蛋白的检测,从而为研究PKR在病毒感染过程中的作用提供了重要的工具.
- 张涛罗维玉姜水涛朱鹏阳李呈军陈化兰孙晓林姜丽
- 关键词：PKR原核表达蛋白纯化多克隆抗体
- 人源肺细胞cDNA文库构建及与流感病毒NP互作宿主蛋白的筛选被引量：6
- 2016年
- 【目的】构建肺组织细胞Calu-3及A549的高质量酵母cDNA文库并筛选与流感病毒NP蛋白相互作用的宿主因子,为深入研究流感病毒NP蛋白功能、病毒复制及致病机制奠定基础。【方法】提取等量Calu-3及A549细胞的总RNA,混合后反转录生成cDNA,利用长距离PCR（LD-PCR）扩增合成dscDNA,用CHROMA SPINTM＋TE-400纯化柱纯化dsDNA,按照Clontech公司的Make Your Own＂Mate＆Plate＂Library System操作程序,将带有同源臂的dscDNA与线性化p GADT7-Rec共同转化Y187酵母感受态细胞,涂布SD/-Leu平板后于30℃培养4d左右,收集所有菌落,混匀分装即为Calu-3和A549细胞cDNA的酵母文库,并对文库库容、滴度及多样性进行分析。利用Eco RⅠ和Bam HⅠ双酶切将A/Auhui/2/2005（H5N1）NP定向插入pGBKT7载体,构建高致病性流感病毒NP的诱饵质粒p GBKT7-NP,经验证该质粒无自激活活性,并进一步采用构建完成的Calu-3/A549细胞酵母文库进行杂交筛选,筛选得到的正确阅读的猎物质粒与诱饵质粒共转Y2H Gold酵母菌,分别以BD-P53/AD-T7作为阳性对照和BD-Lam/AD-T7作为阴性对照,挑取最终在SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-gal/Aro A（SD/-4/X/A）固体培养板上生长良好且变蓝的菌落,即为候选与目标蛋白互作阳性的蛋白,提取酵母质粒,进行测序分析、序列比对和Gene Ontology分析。【结果】提取两种细胞RNA 28S与18S条带清晰,5S条带暗淡,表明所提RNA质量较高,基本无降解;对提取的RNA反转录纯化获得dscDNA,dscDNA条带呈弥散状,片段大小分布于500—2 000bp之间,说明不同丰度及大小的RNA均成功反转录;构建的dscDNA文库库容为1.5×10^7,滴度为2.2×10^8cfu/m L,重组率为88%,PCR鉴定文库插入片段,条带大小不一、多样性好;利用诱饵质粒与文库进行双杂交筛选,回交验证后得到11个与NP蛋白互作的宿主因子。经Gene Ontology分析显示,11个宿主因子参与的生物过程包括：细胞凋亡、胚胎发育、可变剪�
- 罗维玉朱鹏阳张杰胡永浩孔晖晖梁立滨周圆李呈军姜丽陈化兰
- 关键词：流感病毒NP蛋白CDNA文库构建酵母双杂交系统
- 流感病毒NP蛋白与宿主蛋白CAP1相互作用的研究被引量：2
- 2016年
- 流感病毒核衣壳蛋白(NP)是病毒核糖核蛋白复合体(v RNP)的主要组成部分,主要调控病毒基因组的转录和复制。为筛选与流感病毒NP相互作用的宿主蛋白,本研究采用酵母双杂交技术(Y2H)在A549细胞c DNA文库中筛选到与其相互作用的宿主蛋白Adenylate cyclase-associated protein 1(CAP1),并通过酵母回交验证、免疫共沉淀技术(Co-IP)和GST pull down试验进一步证实NP与CAP1之间存在特异性的直接相互作用。此外,利用激光共聚焦试验证实NP与CAP1共定位于A549细胞的细胞质内。在HEK293T细胞中过表达CAP1蛋白后,流感病毒的复制能力下降,表明CAP1对流感病毒复制具有抑制作用。本研究对该蛋白的鉴定为流感病毒的复制机理研究奠定了基础。
- 姜水涛赵玉辉周圆罗维玉张杰李呈军陈化兰姜丽
- 关键词：酵母双杂交NP蛋白相互作用
- 中国2009～2010年H_6亚型AIV的生物学特性研究
- 为了解近年我国H6亚型禽流感病毒的生物学特性，本研究对2009～2010年禽流感流行病学检测期间分离到的18株H6亚型禽流感病毒进行全基因组序列测定、进化分析、同源性比对、抗原性分析、基因组分析，并选取其中8株病毒进行S...
- 罗维玉
- 关键词：进化分析抗原分析
- 文献传递
- 两株鸭源H5N1亚型禽流感病毒的序列分析及致病性研究被引量：4
- 2012年
- 本研究对2010年在湖北活禽市场监测分离到的两株鸭源H5N1亚型禽流感病毒(AIV)(HuB/495/10和HuB/513/10)进行了序列分析和致病性试验研究,以了解湖北地区H5N1亚型AIV的生物学特性差异。序列分析显示:2株病毒全基因组核苷酸同源性在97.3%～98.6%,2株病毒的8个节段基因均与青海和香港分离的野鸟源病毒A/great crested-grebe/Qinghai/1/2009(H5N1)和A/black-crowned night heron/Hong Kong/659/2008(H5N1)的核苷酸高度同源,HA蛋白裂解位点序列基序为341RRRKR345,呈现典型的高致病力分子特征。以105EID50/100μL病毒剂量感染4周龄SPF鸭发现:HuB/495/10和HuB/513/10对鸭的致死率分别为100%和20%,病毒在鸭体内呈全身性复制并可通过呼吸道和消化道向外排毒;不同滴度的病毒感染6周龄BALB/c小鼠,HuB/495/10和HuB/513/10的MLD50分别为1.38 log10EID50和1.68 log10EID50,对小鼠表现为高致病力,均在肺脏中高拷贝复制。
- 王明芳邓国华杨孝朴施建忠丁晴微罗维玉张文亮陈化兰
- 关键词：H5N1亚型禽流感病毒
- 磷脂爬行酶对流感病毒抑制作用及两株埃及H5N1病毒分离鉴定及生物特性研究
- A型流感病毒曾经造成人类历史上数次大流感的暴发,以及2009年甲型H1N1流感大流行,严重威胁人类的健康和生命。对流感的防控和治疗是公共卫生安全的重要内容。应对流感大暴发的策略主要包括:加强平时病毒的监测,准确预测病毒的...
- 罗维玉
- 关键词：NP病毒复制H5N1亚型
- 文献传递
- 应用酵母双杂交系统筛选与流感病毒PB2蛋白相互作用的宿主蛋白
- 2017年
- 流感病毒PB2蛋白可以作用于病毒mRNA转录起始阶段,辅助病毒mRNA引物的合成,并能够影响病毒的宿主范围,参与禽流感病毒在哺乳动物宿主体内的适应过程。本研究利用2009甲型H1N1流感病毒PB2蛋白作为"诱饵"蛋白,通过经典酵母双杂交系统筛选由Calu-3、A549、THP-1和U251 4种细胞构建的cDNA文库,筛选到多个与PB2蛋白相互作用的宿主蛋白。针对其中筛选到的一种宿主蛋白FHL2,进行免疫共沉淀(Co-IP)和激光共聚焦(Confocal)试验,证实了PB2蛋白和FHL2蛋白二者之间存在相互作用,并且转染瞬时过表达FHL2发现该蛋白可以负调控流感病毒复制,为进一步研究PB2蛋白与FHL2蛋白互作及影响病毒复制的分子机制奠定了基础。
- 孙楠梁立滨王金光李俊平罗维玉赵玉辉朱鹏阳姜丽陈化兰李呈军
- 关键词：酵母双杂交免疫共沉淀激光共聚焦FHL2
