刘琳
- 作品数：3 被引量：9H指数：1
- 供职机构：南开大学药学院天津市分子药物研究重点实验室更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金中德国际合作项目中国博士后科学基金更多>>
- 相关领域：生物学农业科学更多>>
- 利用原核表达系统一步法制备生物素标记蛋白质被引量：1
- 2014年
- 传统的蛋白质生物素标记多采用体外化学修饰法,涉及生物素和蛋白质的活化、透析和纯化等多种处理,该方法步骤繁琐,且对目的蛋白的损失较大。本实验利用原核共表达质粒pCDFDuet-1,将含有6个组氨酸标签的人己糖苷酶D(hexosaminidase D,HexD)的cDNA与生物素受体多肽(biotin acceptor peptide,BAP)DNA进行PCR拼接,连入pCDFDuet-1的多克隆位点1(multiple cloning site1,MCS1);将以大肠杆菌Trans5α基因组为模板克隆得到的生物素连接酶(biotin ligase,BirA)基因连入MCS2,构建重组质粒pCDFDuet-hexD-BAP-birA。初步验证后将该质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中,利用0.1 mmol/L的IPTG和80μmol/L的生物素进行诱导表达,采用Ni-NTA亲和层析和超滤对HexD进行纯化,SDS-PAGE检测分子量的大小(60 kDa)和纯度(90%以上)。以anti-HexD和链霉亲和素-HRP为抗体,Western blot检测发现,HexD-BAP表达正确,且被生物素标记;同时以4-MU-O-GalNAc为荧光底物,检测到生物素化标记HexD的糖苷酶活性为3.6 nmol/(min·μg),与未标记HexD的活性(3.06 nmol/(min·μg))相当。结果表明,可以利用BirA及其受体多肽,通过共表达质粒pCDFDuet-1,一步转化、表达和纯化,在大肠杆菌中进行外源蛋白的表达和生物素标记,且不改变目的蛋白的生物活性,可应用于免疫标记、互作蛋白的捕获等生物学研究。
- 谢小丽程剑松王晓敏梅香寒刘琳李静
- 关键词：原核表达生物素标记
- 人己糖胺酶D的原核表达、纯化及酶学特性研究被引量：1
- 2012年
- 糖基化修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰,参与生物体中的信号传导、细胞识别等多种细胞活动,糖基缀合物的正常水解是生物体代谢的必需途径。人己糖胺酶D(Hexosaminidase D)是新发现的一种存在于人细胞质中的切除GalNAc糖基化修饰的外切酶,但该酶的酶学特性尚不清楚。利用PCR的方法,将Hex D的cDNA序列构建到质粒pET3C中,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS后,通过优化异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)浓度(0.1 mmol/L)和诱导时间(10 h)获得了高可溶性表达的重组蛋白酶。采用Ni-NTA亲和层析对重组蛋白进行了纯化,SDS-PAGE检测分子量的大小(58 kDa)和纯度(95%以上)。以4-甲基伞形酮-2-乙酰氨基-2-脱氧半乳糖(4-MU-O-GalNAc)为荧光底物,测定该酶的最适反应pH值为5.5,最适反应温度为37℃,且该酶的热稳定性较好,在50℃下放置半小时仍有较高活性,1mmol/L的金属离子(CuSO4、FeSO4.7H2O、MgCl2.6H2O、CaCl2、NiSO4.6H2O、AlCl3.6H2O、ZnSO4.7H2O、MnCl2)及EDTA对该酶活性影响不大,10mmol/L AlCl3、CuSO、FeSO4.7H2O对该酶有不同程度的抑制。在最适条件下(pH 5.5,37℃)下,该酶的Km为0.16mmol/L,最大反应速率为3.06μmol/(min.mg)。
- 刘琳徐蔡春梅李静蔡玉梅
- 关键词：纯化酶学特性
- 山东省青岛地区兔皮肤真菌病的流行病学调查被引量：7
- 2012年
- 该调查于2009年6月至2010年5月采集山东省青岛地区880份疑似病兔的结痂和皮屑,用沙堡弱培养基培养,镜检其菌丝特点,并收集兔群的相关流行病学资料,最后对这一地区兔皮肤真菌病的流行情况进行分析.结果表明:确诊兔皮肤真菌病病例为162例(18.4%),其中须毛癣菌73例(45.1%),犬小孢子菌56例(34.6%),石膏样小孢子菌31例(19.1%);兔群在0-3月龄时最易感染该病,感染率高达14.3%,夏季为本病的高发季节(3.0%).
- 李代军周玉法刘敬博刘琳蔡玉梅苗增民柴同杰
- 关键词：皮肤真菌病菌丝流行病学特点
