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TFPI-2在乳腺肿瘤不同时期的表达变化及下调机制研究: 组织因子途径抑制物-2/(tissue factor pathway inhibitor-2,TFPI-2/),又称胎盘蛋白-5/(placental protein 5,PP-5/)或基质相关性丝氨酸蛋白酶抑制剂/(m...; 郭泓珅; 关键词：TFPI-2 启动子基因沉默 DNA甲基化表观遗传; 文献传递

抗重组人组织因子途径抑制物1单抗抑制rhTFPI-1的抗凝作用被引量：1: 2006年; 目的研制抗重组人组织因子途径抑制物1单克隆抗体(rhTFPI-1 M cAb),了解其对rhTFPI-1抗凝活性的抑制作用。方法将分泌rhTFPI-1 M cAb的杂交瘤细胞注入经降植烷预处理的Balb/C小鼠腹腔中,诱生腹水。腹水先经硫酸铵沉淀处理,再用rprote in A亲和层析柱进一步纯化。对纯化后的单克隆抗体进行SDS-PAGE检测和W estern b lot分析。并用发色底物法测定rhTFPI-1 M cAb对rhTFPI-1的活性抑制。结果纯化后的抗rhTFPI-1 M cAb经SDS-PAGE检测,其纯度为98%;W estern b lot分析显示其能特异识别rhTFPI-1抗原。发色底物法检测结果表明,其能有效阻断rhTFPI-1的抗FVIIa/TF活性,M cAb浓度为8 mg/L时FVIIa/TF剩余活性达到86%;但对rhTFPI-1的抗FXa活性作用不明显,M cAb浓度为80 mg/L时FXa的剩余活性为48.4%。结论rhTFPI-1 M cAb可明显抑制rhT-FPI-1活性,阻碍rhTFPI-1对TF/FVIIa的抑制活性。纯化后的rhTFPI-1 M cAb的各项鉴定指标均较为理想,rprote inA亲和层析柱纯化方法简便易行值得推广。; 蔡旭白浩孔德升郭泓珅梁旺宋后燕马端; 关键词：单克隆抗体组织因子途径抑制物

重组TFPI缺失突变体TFPI_(1-161)在毕赤酵母中的高效表达及功能鉴定被引量：2: 2004年; 人组织因子途径抑制物 (TFPI)是一种体内天然存在的外源性凝血途径特异性抑制物。缺失突变体TFPI1 - 1 6 1 仅包括TFPI的N末端、K1和K2结构域 ,是一种研究TFPI结构与功能及其相互关系的理想对照分子。以克隆质粒pGEM 3Zf( ) TFPI为模板 ,用PCR方法获得TFPI1 - 1 6 1 基因 ,构建表达质粒pPIC9K TFPI1 - 1 6 1 并转化毕赤酵母GS115。通过筛选多拷贝转化子及优化发酵培养条件 ,首次在毕赤酵母中高效表达了TFPI1 - 1 6 1 ,经纯化后最终产量高于酿酒酵母 2 0倍以上。由于糖基化程度不同 ,TFPI1 - 1 6 1 表达为TFPI1 - 1 6 1 (2 4kD)和TFPI1 - 1 6 1 (2 7kD)两种分子形式 ,其等电点分别为 4 8和 4 9。根据等电点差异 ,二者可通过阴离子交换层析得到分离 ,其活性无显著性差异。经分子筛和阴离子交换层析分离纯化后 ,从 4L发酵培养液中可分别获得 1 4gTFPI1 - 1 6 1 (2 4kD)和 1 8gTFPI1 - 1 6 1 (2 7kD) ,其比活性分别达 12 880u mg和 12 4 0 0u mg ,回收率达 5 5 %。经稀释的凝血酶原时间及发色底物法检测 ,重组TFPI1 - 1 6 1 具有良好的抗凝及抑制FXa活性的作用。为获得大量TFPI1 - 1 6 1 提供了一种廉价高效的蛋白表达纯化方式。; 白浩马端宋后燕莫炜顾银良孔德升郭泓珅; 关键词：组织因子途径抑制物 PICHIA PASTORIS

脾内微量注射免疫法制备抗重组可溶性组织因子单克隆抗体被引量：2: 2006年; 目的制备抗重组可溶性组织因子(r-sTF)单克隆抗体并建立检测组织因子(TF)含量的夹心ELISA法,以期为TF的深入研究及临床应用提供参考依据。方法取微量TF对Balb/c小鼠直接进行脾内注射免疫,分离小鼠脾细胞和鼠骨髓瘤细胞,融合后对杂交瘤细胞进行筛选克隆化培养;建立了3株稳定分泌TF单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1-C3、2-G9、3-H9;进而在小鼠体内诱生腹水,并用rprotein A亲合层析法纯化;经鉴定后用过碘酸钠法将辣根过氧化物酶标记于其中一株单抗上,建立夹心ELISA法测定正常人血浆中的TF含量。结果纯化的单抗用SDS-PAGE测定纯度,在Mr为150 000左右呈现一条带;Western blot测定显示1-C3、2-G9、3-H9分泌的单抗可特异地识别Mr为47 000的TF,经免疫球蛋白(Ig)类和亚类鉴定实验证实3株单抗均为IgG1;用夹心ELISA法检测正常人血浆中的TF含量为(130±80)pg/mL。结论用脾内微量注射法成功制备抗TF单克隆抗体及ELISA测定TF含量方法的建立,为TF的制备纯化和检测奠定了基础,也使TF的临床深入化研究成为可能。; 蔡旭彭卓醇孔德升郭泓珅白浩宋后燕马端; 关键词：免疫单克隆抗体

hTFPI-2的基因克隆表达及生物学性质研究被引量：4: 2006年; 目的克隆人组织因子途径抑制物-2(human tissue fact0r pathway inhibitor-2,hTFPI-2)的编码基因,并在大肠杆菌中表达,获得有活性的目的蛋白。方法应用 RT-PCR 法从人胎盘总 RNA 中获得人组织因子途径抑制物-2的编码基因,将该基因片段克隆至原核表达载体 pET19b 中,转化表达宿主 BL21,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导目的蛋白的表达。获得的包涵体经离子交换法进行纯化,并使其在体外进行复性。采用发色底物法测定 hTFPI-2对纤溶酶、胰蛋白酶的抑制作用;明胶酶谱法测定对基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)的抑制作用;采用人工基底膜法观察hTFP1-2对纤维肉瘤细胞侵袭能力的影响。结果成功获得了序列完全正确 hTFPI-2的编码基因,hTFP1-2在大肠杆菌中以包涵体的形式获得高效表达,占细菌总蛋白的20%～30%。经纯化、复性后可得到纯度大于90%的目的蛋白。复性后的 hTFPI-2具有抑制胰蛋白酶、纤溶酶、MMP-2和 MMP-9的活性,同时亦具有抑制纤维肉瘤细胞 HT-1080侵袭转移的能力结论采用原核表达系统高效地获得了具有活性的 hTFPI-2。; 孔德升郭泓珅蔡旭梁旺彭卓醇宋后燕马端; 关键词：组织因子途径抑制物-2 蛋白质复性基因工程

乳腺癌相关基因的DNA甲基化被引量：1: 2004年; 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。DNA甲基化作为哺乳动物细胞基因组修饰和表达调控的表观遗传学方式 ,在肿瘤的发生发展过程中总体水平降低 ,但同时又伴随某些基因的高甲基化。在乳腺癌中。; 郭泓珅马端; 关键词：乳腺癌 DNA甲基化 CPG岛启动子

长效TFPI突变体的分子设计及性质研究: 组织因子途径抑制物(Tissue Factor Pathway Inhibitor,TFPI)是外源性凝血途径的特异性抑制物,具有抗凝和抗炎的双重作用,对重度败血症、感染性休克/DIC等疾病具有明显的治疗作用.但其半衰期...; 白浩孔德升郭泓珅林伊凤彭卓醇蔡旭张农马端; 关键词：TFPI 突变体半衰期药代动力学; 文献传递

组织因子途径抑制物基因的改造及其在毕赤酵母中的表达: ：实现TFPI全长蛋白在酵母中的分泌表达.方法：通过RNAstructure 4.2分析发现TFPImRNA序列中存在可能影响蛋白翻译的茎环结构.利用PCR方法对相关序列进行同意突变完成基因优化.以pPIC9K为载体构建...; 粱旺孔德生蔡旭郭泓珅彭卓醇刘静马端; 关键词：组织因子途径抑制物基因结构毕赤酵母分泌表达

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郭泓珅