蒋华
- 作品数：11 被引量：8H指数：1
- 供职机构：上海交通大学医学院附属仁济医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家教育部博士点基金上海市科学技术委员会科研基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 嵌合抗原受体T细胞治疗面临的挑战与对策被引量：1
- 2019年
- 嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell,CAR-T)疗法是一种新兴的免疫治疗手段,其原理是将来自患者外周血的T细胞在体外进行编辑扩增后,使T细胞表面表达特异性的嵌合抗原受体,再将T细胞回输至患者体内,使其特异性地识别和杀伤肿瘤细胞,且不依赖于主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)分子的限制。目前,靶向CD19的CAR-T细胞在血液肿瘤的治疗中已获得了令人振奋的抗肿瘤效果。然而,CAR-T细胞在治疗肿瘤的过程中仍存在很多问题,例如不良反应、肿瘤复发和实体瘤疗效等,特别是在实体肿瘤中靶点选择、CAR-T浸润和存活以及肿瘤免疫抑制微环境等问题仍未有突破性进展。本文总结了近年来CAR-T细胞治疗在临床中的应用现状,从肿瘤抗原异质性、肿瘤微环境和靶点选择3个方面归纳了CAR-T细胞治疗面临的挑战,并结合最新研究进展提出了应对策略。
- 董一唯蒋华
- 关键词：免疫疗法肿瘤微环境
- 诱导表达IL-18的GPC3-CAR-T细胞对小鼠肝细胞癌的治疗作用被引量：1
- 2020年
- 目的:构建靶向磷脂酰肌醇蛋白多糖3(glypican 3,GPC3)、可诱导表达白细胞介素18(interleukin-18,IL-18)的小鼠嵌合抗原受体修饰T淋巴细胞(chimeric antigen receptor-modified T cells,CAR-T),分别在小鼠体内及体外评价该CAR-T细胞的抗肿瘤作用。方法:采用基因工程技术构建重组GPC3-mBBZ和GPC3-mBBZ-mNFAT6-mIL18反转录病毒载体,并用病毒感染法制备CAR-T细胞。分别采用FCM和蛋白质印迹法检测病毒感染后T细胞中CAR的表达情况;实时荧光定量PCR检测GPC3蛋白激活后的CAR-T细胞中IL-18 mRNA的表达水平。采用非放射性细胞毒性实验和ELISA法评价CAR-T细胞对Hepa1-6-GPC3细胞特异性免疫杀伤作用。采用FCM法检测诱导表达IL-18对T细胞CD4/CD8分化及抗凋亡能力的影响。在建立的GPC3阳性肝细胞癌Hepa1-6-GPC3细胞皮下移植瘤小鼠模型中评价GPC3-mBBZ-mNFAT6-mIL18 CAR-T细胞的体内抗肿瘤作用。通过免疫组织化学染色和CAR拷贝数检测分析CAR-T细胞在肿瘤组织内的浸润和存活情况。采用FCM法检测小鼠肿瘤浸润T细胞的表型。结果:成功构建反转录病毒载体GPC3-mBBZ和GPC3-mBBZ-mNFAT6-mIL18,并制备获得CAR-T细胞。激活后的GPC3-mBBZ-mNFAT6-mIL18 CAR-T细胞可有效表达IL-18 mRNA(P<0.05)。相较于GPC3-mBBZ CAR-T细胞,GPC3-mBBZ-mNFAT6-mIL18 CAR-T细胞对GPC3阳性肝细胞癌具有更强的特异性杀伤能力(P<0.01)和抗凋亡能力,而且存活细胞数明显增多(P<0.05)。与未经处理的T细胞相比,GPC3-mBBZ CAR-T细胞和GPC3-mBBZ-mNFAT6-mIL18 CAR-T细胞均能有效抑制甚至清除小鼠GPC3阳性肝细胞癌移植瘤(P值均<0.05),抑瘤率分别为85.7%和70.7%;而且,与GPC3-mBBZ CAR-T细胞相比,GPC3-mBBZ-mNFAT6-mIL18 CAR-T细胞在肿瘤组织内的浸润明显增多(P<0.05)。GPC3-mBBZ-mNFAT6-mIL18 CAR-T细胞组中肿瘤浸润T细胞低表达程序性死亡受体1,高表达颗粒酶B,且CD8^+T细胞所占比例增高。结论:GPC3-mBBZ-mNFAT6-mIL18 CAR-T细胞在GPC3阳性的肝细胞
- 苏靖雯骆红李宗海蒋华
- 关键词：白细胞介素18细胞治疗
- 抗IGF-Ⅰ R抗体联合顺铂对卵巢癌细胞及其移植瘤的抑制作用
- 2014年
- 目的:观察抗胰岛素样生长因子Ⅰ型受体(insulin-like growth factor-Ⅰreceptor,IGF-ⅠR)单克隆抗体4F2联合顺铂对卵巢癌细胞及其移植瘤的生长抑制作用。方法:Western blotting检测4种卵巢癌细胞(CAOV3、ES2、SKOV3和Hey细胞)中IGF-ⅠR的表达;流式细胞术检测抗IGF-ⅠR单抗4F2与各卵巢癌细胞系的结合特异性;Western blotting检测4F2对SKOV3和CAOV3细胞内IGF-ⅠR磷酸化水平的影响,CCK-8检测4F2、顺铂单用或联用对卵巢癌细胞的生长抑制作用;建立卵巢癌SKOV3、CAOV3细胞裸鼠移植瘤模型,观察4F2、顺铂单用或联合治疗对裸鼠移植瘤生长的抑制作用。结果:IGF-ⅠR在4种卵巢癌细胞中的表达水平由高到低为SKOV3、CAOV3、ES2,Hey细胞不表达,4F2与SKOV3、CAOV3、ES2细胞均能特异性结合,并且4F2能够抑制IGF-ⅠR的酪氨酸磷酸化。联合组顺铂为0.2μg/ml时细胞生长抑制率即显著高于4F2单抗组[SKOV3:(47.4±3.1)%vs(5.3±0.6)%;t=3.126,P=0.007。CAOV3:(51.6±2.3)%vs(8.2±1.8)%;t=3.516,P=0.009]及顺铂组[SKOV3:(47.4±3.1)%vs(30.5±4.1)%;t=2.933,P=0.027。CAOV3:(51.6±2.3)%vs(28.9±2.3)%;t=3.226,P=0.034];在体内,联合组对卵巢癌种植瘤小鼠肿瘤的抑制率亦显著高于4F2单抗组[SKOV3:(87.3±3.1)%vs(41.6±4.9)%;t=2.29,P=0.004 3。CAOV3:(86.6±3.5)%vs(42.1±7.7)%;t=3.02,P=0.009 1]及顺铂组[SKOV3:(87.3±3.1)%vs(28.9±5.5)%;t=2.56,P=0.008 7。CAOV3:(86.6±3.5)%vs(32.7±4.1)%;t=2.91,P=0.007 3]。结论:4F2单抗特异性结合IGF-ⅠR阳性卵巢癌细胞,联合顺铂能够协同抑制卵巢癌细胞及其移植瘤的生长。
- 张彭南高慧萍张鹏飞孙红蒋华
- 关键词：胰岛素样生长因子I型受体顺铂卵巢癌
- EpCAM蛋白的表达、纯化及其单克隆抗体的制备
- 2012年
- 目的:原核表达EpCAM蛋白并制备抗EpCAM特异性单克隆抗体,初步鉴定相应单克隆抗体的特性。方法:PCR扩增EpCAM基因胞外区,将目的基因亚克隆至载体pET-28a(+),转化至大肠埃希菌株BL21,IPTG诱导表达,组氨酸亲和层析法纯化表达产物。纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,将成功免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融合,经ELISA筛选得到分泌特异性抗EpCAM的单克隆抗体的细胞株,免疫BALB/c小鼠进一步制备相应的单克隆抗体,并通过Western blot(蛋白质印记)和FACS(流式细胞分析)鉴定单抗的特异性及生物学活性。结果:成功构建重组表达载体pET28a-EpCAM并在大肠杆菌中获得表达,经His-tag亲和层析法获得纯化的EpCAM重组蛋白。EpCAM重组蛋白免疫的BALB/c小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合、筛选,获得两株稳定分泌EpCAM抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为4B2、2F2并免疫BALB/c小鼠获得相应的单克隆抗体。Western blot结果显示4B2腹水纯化所得单抗能够识别FaDu细胞系(人咽鳞癌细胞)中的EpCAM蛋白,但2F2未能识别FaDu细胞中的变性的EpCAM蛋白。FACS结果显示两者均能和FaDu细胞中天然的EpCAM蛋白结合。讨论:成功制备了抗EpCAM的单克隆抗体,并能够识别人咽鳞癌细胞系FaDu中表达的EpCAM,为进一步研究EpCAM抗体在肿瘤治疗中的作用提供基础。
- 孔娟高慧萍张鹏伟石必枝蒋华严瑾李宗海
- 关键词：EPCAM杂交瘤单克隆抗体
- 单克隆抗体CH12抑制EGFRvⅢ阳性表达的肺鳞癌的生长被引量：1
- 2016年
- 目的:探讨特异性针对表皮生长因子受体变异体Ⅲ(epidermal growth factor receptor variantⅢ,EGFRvⅢ)的单克隆抗体CH12(CH12单抗)对EGFRvⅢ阳性表达的肺鳞癌生长的影响。方法:采用慢病毒感染的方法建立EGFRvⅢ过表达的人肺鳞癌SK-MES-1-EGFRvⅢ和NCI-H520-EGFRvⅢ细胞。FCM法检测CH12单抗与SKMES-1-EGFRvⅢ和NCI-H520-EGFRvⅢ细胞的结合能力。检测由CH12单抗诱导的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)对SK-MES-1-EGFRvⅢ和NCI-H520-EGFRvⅢ细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)。裸鼠皮下接种SK-MES-1-EGFRvⅢ细胞,建立EGFRvⅢ过表达的肺鳞癌裸鼠移植瘤模型。实验分为3组:(1)腹腔注射CH12单抗组;(2)腹腔注射PBS组(阴性对照);(3)腹腔注射人鼠嵌合性C225单克隆抗体(阳性对照);观察裸鼠体内肿瘤的生长情况,并绘制生长曲线。结果:成功构建了EGFRvⅢ过表达的肺鳞癌SK-MES-1-EGFRvⅢ和NCI-H520-EGFRvⅢ细胞;FCM法检测结果显示,CH12单抗能够与SK-MES-1-EGFRvⅢ及H520-EGFRvⅢ细胞高度结合,而与亲本SKMES-1及NCI-H520细胞不结合。ADCC结果表明,CH12单抗能够介导PBMCs对SK-MES-1-EGFRvⅢ及H520-EGFRvⅢ细胞的细胞毒杀伤作用(P值均<0.01)。对裸鼠体内移植瘤的治疗结果显示,CH12单抗能够完全清除裸鼠体内的SK-MES-1-EGFRvⅢ细胞移植瘤。结论:体外和体内研究均证实,CH12单抗对EGFRvⅢ过表达的肺鳞癌细胞的生长具有明显的抑制作用。
- 毕延玉蒋华李宗海孔宪明
- 关键词：单克隆抗体
- 成胶质细胞瘤中EGFR靶向治疗耐药机制的研究进展被引量：1
- 2016年
- 多形性成胶质细胞瘤（GBM）是成人中发病率较高的神经系统恶性肿瘤。研究表明,约40%~60%的胶质瘤有表皮生长因子受体（EGFR）过量表达和基因扩增,其中约40%伴随着EGFR突变,目前已有多个针对EGFR的靶向药物用于临床肿瘤治疗,然而在GBM患者的临床应用中,EGFR靶向治疗却鲜有成效。如何克服靶向治疗过程中出现的原发或继发性耐药,对医学工作者而言仍然是一个巨大挑战。本文将对EGFR靶向药物在GBM中的主要耐药机制进行综述。
- 吴秀奇蒋华李宗海
- 关键词：表皮生长因子受体成胶质细胞瘤耐药机制靶向治疗
- CAR-T细胞治疗消化系统肿瘤的研究进展
- 2017年
- 消化系统肿瘤具有高发病率、高病死率的特点,在我国的肿瘤谱中,消化系统肿瘤占一半以上。对于消化系统肿瘤,目前最有效的手段仍然是手术,但是一旦缺乏手术指征,就几乎没有特别有效的治疗手段。因此,亟需发展新型的治疗手段。嵌合抗原受体修饰的T细胞(CAR-T)无疑是最令人期待的治疗手段之一,目前已经有多个针对消化系统肿瘤的临床试验正在开展。最近,个别方案已经取得了令人兴奋的临床研究结果。将对最新进展作一简要综述。
- 陈慕华蒋华李宗海
- 关键词：免疫治疗消化系统肿瘤
- 可诱导表达IL-12的GPC3靶向性CAR-T细胞在免疫健全小鼠中的抗乳腺癌作用被引量：3
- 2018年
- 目的 :构建能够诱导表达白细胞介素12(interleukin-12,IL-12)且靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican 3,GPC3)的小鼠嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)修饰的T淋巴细胞(CAR-modi ed T lymphocyte,CAR-T),并探讨CAR-T细胞对免疫健全小鼠中GPC3阳性乳腺癌生长的作用。方法 :采用基因重组的方法,构建编码GPC3特异性CAR的反转录病毒载体(m9.28z),以及同时编码GPC3特异性CAR和活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells,NFAT)-IL-12表达系统的反转录病毒载体(m9.28z/IL-12),包装反转录病毒并感染小鼠T细胞,制备成CAR-T细胞。采用细胞毒性杀伤实验和ELISA法检测CAR-T细胞的体外生物学功能。进一步在C57BL/6小鼠体内建立GPC3阳性乳腺癌细胞E0771-GPC3的皮下移植瘤模型,然后分别注射5×10~6个小鼠未转导T细胞(murine untransduced T cells,m UTD)(作为对照组)以及5×10~6个m9.28z CAR-T细胞、2×10~6个m9.28z CAR-T细胞、5×10~6个m9.28z/IL-12 CAR-T细胞和2×10~6个m9.28z/IL-12 CAR-T细胞(作为实验组);观察裸鼠体内肿瘤的生长情况,并采用免疫组织化学法检测肿瘤组织中叉头框蛋白P3(forkhead box protein P3,FOXP3)和CD8α的表达水平。结果 :成功构建了m9.28z和m9.28z/IL-12载体,并制备了m9.28z CAR-T细胞和m9.28z/IL-12 CAR-T细胞。在体外功能实验中,相比于m9.28z CAR-T细胞,m9.28z/IL-12 CAR-T细胞不仅能够有效杀伤GPC3阳性乳腺癌细胞,而且可以分泌更多的细胞因子如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)(P值均<0.05)。在GPC3阳性乳腺癌移植瘤模型小鼠体内,相比于m9.28z CAR-T细胞,m9.28z/IL-12 CAR-T细胞能够明显抑制移植瘤生长(P<0.001),肿瘤组织中CD8+T细胞浸润更多(P<0.01),而调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)浸润更少(P<0.01)。结论 :可诱导表达IL-12的GPC3靶向性CAR-T细胞(即m9.28z/IL-12CAR-T细胞)不仅在体外能够展现更好的抗肿瘤能力,而且在免疫健�
- 刘莹李宗海蒋华
- 关键词：白细胞介素12
- 二甲双胍诱导的干细胞样记忆性嵌合抗原受体-T细胞对小鼠多发性骨髓瘤移植瘤的治疗作用
- 2021年
- 目的:探讨体外培养过程中加入二甲双胍对靶向B细胞成熟抗原(B cell maturation antigen,BCMA)的嵌合抗原受体-T细胞(chimeric antigen receptor-T cells,CAR-T)分化及抗肿瘤能力的影响。方法:从健康人外周血单个核细胞中提取并活化T细胞,采用病毒感染法制备BCMA-BBZ CAR-T细胞。二甲双胍诱导组为CAR-T细胞扩增过程同时加入重组人白细胞介素7(recombinant human interleukin-7,rhIL-7)、rhIL-21和二甲双胍进行诱导,非二甲双胍诱导组为只使用细胞因子诱导的CAR-T细胞,空白对照组为未转导慢病毒的T细胞。采用FCM法检测CAR-T细胞中CAR的表达水平、记忆表型和凋亡情况,非放射性细胞毒性实验评价CAR-T细胞对人多发性骨髓瘤RPMI-8226细胞的特异性免疫杀伤作用。用RPMI-8226细胞连续多轮刺激后,检测CAR-T细胞的记忆表型和对RPMI-8226细胞的毒性杀伤功能。构建RPMI-8226细胞小鼠移植瘤模型,输注各组CAR-T细胞后,记录小鼠的肿瘤体积、体质量、生存期,检测CAR-T输注14 d后小鼠外周血中淋巴细胞数量。结果:二甲双胍诱导后的CAR-T细胞,CD8~+T细胞中干细胞样记忆T细胞(stem-cell memory T cell,Tscm)(CD95high CD45RAhigh CCR7high)所占比例明显增多(P<0.05)。在经过连续2轮RPMI-8226细胞刺激后,CD8~+T细胞中仍保持较高的Tscm比例。与未转染慢病毒的T细胞相比,二甲双胍诱导组和非二甲双胍诱导组CAR-T细胞均能有效抑制甚至清除肿瘤(P<0.01和P<0.0001),但2组CAR-T细胞的疗效差异无统计学意义(P>0.05)。进一步研究显示,相较于非二甲双胍诱导的CAR-T细胞治疗组二甲双胍诱导的CAR-T细胞治疗组小鼠外周血中CD8^(+)T细胞数明显更多(P<0.05),小鼠生存期也具有一定的存活受益。结论:二甲双胍具有维持CAR-T细胞低分化的作用,其诱导的Tscm富集可在连续培养和接受连续抗原刺激后维持。二甲双胍诱导的CAR-T细胞能够有效抑制肿瘤生长。
- 董一唯孙艳莎李宗海蒋华
- 关键词：多发性骨髓瘤二甲双胍
- 单克隆抗体CH12抑制头颈部鳞状细胞癌裸鼠种植瘤的生长被引量：1
- 2012年
- 目的:观察嵌合型单克隆抗体CH12对头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinomas,HNSCC)裸鼠种植瘤生长的抑制作用,为进一步研究CH12单抗在肿瘤治疗中的作用提供参考数据。方法:Western blotting检测5种HNSCC细胞系A253、CAL27、Detroit 562、FaDu和RPMI 2650中表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的表达,流式细胞术检测CH12单抗同这5种细胞系的结合能力。皮下接种CAL27和A253细胞,建立HNSCC裸鼠种植瘤模型。模型鼠腹腔注射CH12单抗,以PBS作为阴性对照,观察肿瘤生长情况,绘制肿瘤生长曲线。结果:EGFR在CAL27、A253、FaDu及Detroit 562细胞中均有不同程度的表达,其中CAL27细胞中EGFR的表达水平最高,A253细胞次之。CH12单抗与5种HNSCC细胞系的结合能力由高到低依次为CAL27、FaDu、A253、Detroit 562和RPMI 265细胞。CH12单抗对CAL27和A253细胞裸鼠种植瘤的生长均有显著抑制作用,抑瘤率分别为56.8%(P=0.022)和59.7%(P=0.015)。结论:单克隆抗体CH12对EGFR高表达的HNSCC细胞种植瘤的生长具有明显的抑制作用。
- 杨雅琼李宗海胡素文蒋华
- 关键词：单克隆抗体表皮生长因子受体头颈部鳞状细胞癌
