程朝飞
- 作品数：11 被引量：26H指数：3
- 供职机构：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所动物营养学国家重点实验室更多>>
- 发文基金：国家公益性行业科研专项国家高技术研究发展计划国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学医药卫生更多>>
- 基于狂犬病病毒重组蛋白的ELISA检测方法的建立及其初步应用
- 目的：原核表达狂犬病病毒的基质蛋白(M)，并以此作为包被抗原建立问接ELIsA检测方法，与以狂犬病病毒磷蛋白(P)作为包被抗原建立的间接ELIsA方法进行比较。方法：根据GenBank中公布的狂犬病病毒LEP—Flury...
- 程朝飞宫苗苗王勇田康乐赵占中李刚
- 关键词：狂犬病病毒基质蛋白原核表达
- 小反刍兽疫病毒M基因截短表达及鉴定
- 2012年
- 目的将小反刍兽疫病毒M蛋白基因截短表达后用于特异性单抗制备及临床抗体水平检测。方法:用在线分析软件BepiPred分析小反刍兽疫病毒M蛋白潜在的B细胞线性表位,以本实验室构建的pCR2.1T-PPRV M质粒为模板,扩增三段截短的M基因,纯化后的PCR产物分别与克隆载体pCR2.1T连接,筛选出的阳性重组质粒经双酶切后,分别与表达载体pET-32a(+)及pGEX-6p-1连接,再将鉴定为阳性的重组质粒转化入E.coli BL21(DE3)菌株诱导表达,并用SDS-PAGE及Western blot验证。结果 PCR产物电泳,得到与预期大小相符的特异性片段。对连接克隆载体及表达载体的重组质粒双酶切后,均出现与预期一致的片段,DNA测序表明,插入片段序列与小反刍兽疫Nigeria75/1株M蛋白基因完全一致。重组蛋白经SDS-PAGE及Western blot鉴定,证明所构建的重组蛋白均获得高效表达,并均具有良好的反应原性。结论成功表达了小反刍兽疫截短M基因的蛋白,为制备特异性单抗及小反刍兽疫抗体检测奠定了一定基础。
- 黄华欣李刚王勇金红岩陶春爱程朝飞隋修锟
- 关键词：小反刍兽疫病毒M基因
- 小反刍兽疫病毒F蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备被引量：5
- 2012年
- 目的原核表达小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)F蛋白,并制备多克隆抗体。方法根据GenBank中登录的PPRV Nigeria 75/1株F基因全长序列,采用DNAStar软件设计去除F基因信号肽和跨膜区的引物,进行RT-PCR扩增,并克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达。表达的重组蛋白纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析,免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,并初步应用于PPRV的检测。结果重组原核表达质粒pET-32a(+)-PPRV-F经双酶切和测序证实构建正确;表达的重组F蛋白相对分子质量约59 000,诱导6 h表达量最高,且主要以包涵体形式表达;纯化的重组蛋白纯度可达95%以上;免疫小鼠制备的多抗能与纯化的重组蛋白发生特异性反应,抗体效价高于1∶64 000;间接免疫荧光试验显示,制备的多抗能够识别PPRV Nigeria 75/1株全病毒抗原。结论原核表达了PPRVF蛋白,并制备了高效价的多克隆抗体,为其进一步研究及小反刍兽疫临床快速检测方法的建立奠定了基础。
- 田康乐李刚邱文英程朝飞
- 关键词：小反刍兽疫病毒F蛋白原核细胞基因表达多克隆抗体
- 四株鸽Ⅰ型副黏病毒的分离鉴定及基因型分析被引量：3
- 2013年
- 为掌握安徽省鸽Ⅰ型副黏病毒病的流行特点及其与鸡新城疫各分离株的相互关系,对从安徽省不同鸽场鸽病料中分离的4株病毒(AH-2012、AH-2012-1、AH-2012-2、AH-2012-3),采用RT-PCR、血清学试验及基因序列测定等方法进行鉴定。结果显示,这些分离株均具有血凝性,并能使NDV标准阳性血清特异性抑制;PCR扩增出F基因特异性目的片段,其核苷酸序列与GenBank上登录的鸽Ⅰ型副黏病毒的同源性较高,相似性达94.8%;与传统的鸡源新城疫病毒标准株LaSota、F48E9的同源性较低,相似性约为80%;F基因编码蛋白的第112～117位氨基酸序列为R-R-Q-K-R-F。结果表明,这些毒株为鸽Ⅰ型副黏病毒,属于基因Ⅵ型。
- 隋修锟李刚李铁吴迪程朝飞陶春爱黄华欣
- 关键词：F基因
- 狂犬病病毒基质蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立被引量：8
- 2013年
- 目的以原核表达的狂犬病病毒M蛋白作为检测抗原,建立间接ELISA方法用来检测狂犬病病毒抗体。方法为表达狂犬病病毒(RV)基质蛋白(M),采用RT-PCR方法从狂犬病病毒Flury-LEP株中扩增RV基质蛋白基因,双酶切后定向克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-M。将重组质粒pET-M转化至宿主菌E.coli Rosetta中进行表达。SDS-PAGE和Western blot分析确定蛋白表达量和特异性。用纯化的重组M蛋白作为包被抗原建立检测犬RV抗体的间接ELISA方法,通过优化反应条件,确定抗原最佳包被量、血清的最佳稀释度、Protein A-HRP的最佳稀释度。结果经PCR、双酶切及测序鉴定,重组质粒pET-M构建成功,将重组质粒进行转化后诱导表达,经SDS-PAGE电泳分析得到高效表达的M蛋白,重组蛋白可被RV阳性血清特异性识别,表明基质蛋白具有良好的反应原性。用表达的狂犬病病毒M蛋白建立了检测RV抗体的间接ELISA方法,用该间接ELISA方法与以狂犬病病毒作为诊断抗原的商品化ELISA试剂盒分别对93份临床血清样品进行检测,结果两者的符合率为89.2%。结论用原核表达的重组M蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA方法可用做检测犬RV抗体水平的参考。
- 宫苗苗曾妮程朝飞李刚
- 关键词：狂犬病病毒基质蛋白原核表达蛋白纯化酶联免疫吸附试验
- 鸽Ⅰ型副粘病毒与鸡新城疫病毒的F0裂解位点生物信息学分析比较
- 为进一步探究鸽Ⅰ型副粘病毒与鸡源新城疫F0裂解位点附近序列存在的差异，利用生物信息学软件对分离的鸽Ⅰ型副粘病毒与GenBank已发表的标准鸡新城疫毒株相应F0裂解位点附近序列进行分析。结果表明：鸽Ⅰ型副粘病毒与鸡新城疫核...
- 隋修锟李刚程朝飞马震原
- 关键词：鸡新城疫病毒核苷酸序列基因结构生物信息学
- 基于狂犬病病毒重组蛋白的ELISA检测方法比较研究
- 2012年
- 原核表达狂犬病病毒的基质蛋白(M),并以此作为包被抗原建立间接ELISA检测方法,与以狂犬病病毒磷蛋白(P)作为包被抗原建立的间接ELISA方法进行比较。根据GenBank中公布的狂犬病病毒LEP-Flury株M基因序列设计特异性引物并引入SmaⅠ和NotⅠ酶切位点,经RT-PCR扩增得到目的基因,连接pCR 2.1载体,构建重组质粒pCR-RV-M,重组质粒用SmaⅠ和NotⅠ进行双酶切,酶切产物定向克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中,构建重组表达载体pGEX-RV-M。将重组表达载体转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,使用IPTG诱导表达目的蛋白,SDS-PAGE分析表明蛋白表达量较大,且主要以可溶性的形式表达。亲和层析纯化目的蛋白,Westernblot表明融合蛋白具有良好的反应原性,使用纯化的融合蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA方法并检测了95份血清,同时使用带有His标签的重组狂犬病病毒磷蛋白P(RV-His-P)建立的ELISA方法和商品化的ELISA试剂盒检测该血清。结果表明:与商品化的以全病毒作为包被抗原的ELISA检测试剂盒相比,使用重组P蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA检测方法具有更高的符合率,能够代替全病毒作为诊断抗原建立检测方法。
- 程朝飞宫苗苗田康乐王勇赵占中史利军李刚
- 关键词：狂犬病病毒间接ELISA
- 小反刍兽疫病毒Nigeria75/1株磷蛋白的表达及磷酸化位点的预测被引量：3
- 2013年
- 为深入研究小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)P蛋白对病毒复制的影响,以小反刍兽疫病毒Nigeria75/1株为研究对象,通过RT-PCR法扩增P基因,将扩增出的P基因克隆到pGEX-6P-1原核表达载体中,成功构建pGEX-6P-1-PPRV-P表达载体,测序鉴定无误后转化至表达宿主菌BL21(DE3)plysS中进行IPTG诱导表达,并通过在线软件预测了P蛋白的磷酸化位点。结果显示,pGEX-6P-1-PPRV-P重组菌在IPTG浓度1.0mmol/L时经37℃诱导4h,目的基因可正确表达,并以可溶性的形式存在。经Western-blot鉴定,目的蛋白可与PPRV Nigeria75/1株病毒小鼠阳性血清发生特异性的免疫印迹反应,证明表达的蛋白具有较好的反应原性。经综合预测分析,可能被磷酸化的位点有46个,其中PKC、PKA、CKII/CKI、cdc2可能作用的位点分别为15个、7个、10个、6个,其他激酶作用位点可能为8个。结果表明,P蛋白的克隆表达及磷酸化位点的成功预测为小反刍兽疫病毒的深入研究奠定了基础。
- 金红岩封家旺李文超程朝飞隋修锟黄华欣李刚
- 关键词：小反刍兽疫病毒原核表达磷酸化位点
- 抗狂犬病病毒核蛋白单链抗体的表达及活性鉴定被引量：4
- 2013年
- 为了获得抗狂犬病病毒(RV)核蛋白(N)的单链抗体,从分泌抗狂犬病病毒核蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株1D9中提取总RNA,经RT-PCR扩增得到抗体的轻链可变区基因和重链可变区基因,利用重叠引物延伸法将轻链可变区基因和重链可变区基因连接,同时引入连接肽编码序列,成功扩增得到单链抗体(ScFv)基因,将ScFv基因克隆至原核表达载体pET-32a(+),转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后得到融合蛋白。SDS-PAGE和Western-blot分析结果表明,融合蛋白大小约为32ku,主要以包涵体的形式存在,能被抗His标签的单克隆抗体特异性识别。间接竞争ELISA检测结果表明,该单链抗体能够与RV-His-N重组蛋白和RV结合。抗RV核蛋白单链抗体的成功表达,为单链抗体在狂犬病的诊断和治疗中的进一步研究奠定了基础。
- 程朝飞宫苗苗李刚赵占中朱鸿飞袁维峰史利军
- 关键词：单链抗体原核表达活性鉴定
- 抗狂犬病病毒N蛋白单克隆抗体的制备与鉴定被引量：2
- 2011年
- 目的制备抗狂犬病病毒N蛋白单克隆抗体,为建立快速准确的狂犬病病毒抗原检测方法奠定基础。方法将狂犬病病毒Flury LEP株N基因克隆至pGEX-6P-1表达载体中,将纯化后的pGEX-6P-1-RV-N蛋白免疫BALB/c小鼠3次。取小鼠脾脏细胞和SP2/0细胞融合后,用pET-32a-RV-N重组蛋白作为筛选抗原,经3次亚克隆筛选后得到1D9、2B6、3C5、6B5及5F2 5株单克隆抗体细胞株。亚类鉴定结果表明,其中1D9、2B6、6B5 3株亚类为IgG1,3C5、5F2的亚类为IgM。间接ELISA方法检测2B6单抗细胞腹水效价可达1∶106。经Protein G亲和层析柱纯化和脱盐后可得到浓度为2.5mg/mL的高纯度的单克隆抗体。其免疫荧光试验结果表明5株单克隆抗体均能特异地与狂犬病病毒结合。结论制备的单抗具有良好的特异性和敏感性,为后期诊断方法的建立奠定了基础。
- 曾妮宫苗苗程朝飞黄华欣郭李平李刚
- 关键词：狂犬病病毒N蛋白单克隆抗体
