江山
- 作品数：28 被引量：127H指数：7
- 供职机构：重庆医科大学更多>>
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- 相关领域：医药卫生更多>>
- 重组结核分枝杆菌CFP10-ESAT-6融合蛋白的制备及应用研究被引量：21
- 2004年
- 目的 制备重组培养滤液蛋白 10和 6 0 0 0早期分泌性抗原靶的融合蛋白 (rCFP10 ESAT 6 ) ,研究其免疫学特性 ,评价其在结核病血清学诊断中的价值。方法 用基因拼接 (GeneSOEing)法扩增lhp ESAT 6融合基因、并克隆入pQE30质粒 ,表达、纯化rCFP10 ESAT 6蛋白 ,通过Westernblot分析其抗原性。建立豚鼠BCG免疫模型和结核分枝杆菌强毒株 (H3 7Rv)感染模型 ,建立以融合蛋白为抗原的酶联免疫吸附测定 (ELISA)法 ,检测豚鼠血清中的抗结核分枝杆菌抗体 ,并与以纯化蛋白衍生物 (PPD)为抗原的ELISA法比较。结果 重组质粒pQE30 CFP10 ESAT 6靶基因的测序结果与预计序列 (lhp linker ESAT 6 )完全一致。融合蛋白在DH5α菌中以可溶性非包涵体形式存在 ,表达量占菌体总蛋白的 4 0 % ,分子质量为 2 6 0 0 0 ,纯化后的蛋白纯度为 98% ,浓度为 1 2 g/L。Westernblot分析表明 ,融合蛋白与活动性肺结核患者血清、兔抗CFP10血清和兔抗ESAT 6血清都能发生特异性免疫反应。以 10只生理盐水处理豚鼠血清的平均吸光度 (A)值 + 2s为正常界限值 ,以融合蛋白为抗原 ,11份H3 7Rv感染豚鼠血清全部呈阳性反应 ,11份BCG免疫豚鼠血清仅 1份呈阳性反应 ;以PPD为抗原 ,11份H3 7Rv感染豚鼠血清全部呈阳性反应 ,11份BCG免疫豚鼠血清也?
- 陈全朱道银骆旭东蒋英江山
- 关键词：重组结核分枝杆菌
- Ag85B-MPT64融合基因疫苗对鼠结核分枝杆菌感染的保护作用被引量：6
- 2004年
- 目的 研究Ag85B MPT6 4 (AM)融合基因疫苗对鼠结核分枝杆菌感染的保护效果。方法 C5 7BL/ 6小鼠 6 3只 ,随机分为磷酸盐缓冲液 (PBS)、空质粒、卡介苗 (BCG)、pcDNA/Ag85B、pcDNA/MPT6 4、pcDNA/Ag85B +pcDNA/MPT6 4、pcDNA/AM组 ,采用肌肉注射法免疫小鼠 ,0、3、6周各 1次 ,BCG组只在 0周予皮内注射卡介苗 1次。末次免疫后第 5周用H37Rv经尾静脉注射实施攻击 ,攻击后 6周处死部分小鼠 ,测血清总IgG ,特异性脾淋巴细胞增殖、IFN γ及IL 4分泌水平 ;观测脾、肺组织荷菌量和病理学检查以及剩余小鼠的存活时间。结果 AM基因疫苗组诱导的特异性的IgG、脾淋巴细胞增殖和IFN γ的分泌以及肺、脾组织荷菌量、病理学改变和小鼠存活时间明显优于其他DNA疫苗单独免疫组。结论 AMDNA疫苗在抗结核分枝杆菌感染过程中具有明显的免疫保护作用。
- 骆旭东朱道银江山陈全蒋英
- 关键词：DNA疫苗结核分枝杆菌免疫疗法
- 结核分枝杆菌Ag85B与IL-12基因真核共表达质粒的构建及表达被引量：4
- 2004年
- 目的 :构建结核分枝杆菌Ag85B和鼠IL 12基因的共表达载体pBud85B IL12。方法 :将结核分枝杆菌Ag85B基因和鼠IL 12基因同时克隆入含多启动子的共表达载体pBudCE4 .1中 ,构建真核共表达质粒pBud85B IL12。以pBud85B IL12转染COS 7细胞 ,通过RT PCR及ELISA方法检测目的基因的表达。结果 :在COS 7细胞中同时可检测到Ag85B和IL12的表达。结论 :pBud85B IL12共表达质粒的成功构建 ,为对其免疫原性。
- 江山朱道银骆旭东陈全蒋英
- 关键词：结核分枝杆菌AG85BIL-12
- 用结核分枝杆菌HSP70启动子构建分枝杆菌穿梭表达质粒的研究
- 2003年
- 目的 :用结核分枝杆菌HSP70 (Heatshockprotein70 ,HSP70 )启动子改建分枝杆菌穿梭质粒 pJEM11为分枝杆菌穿梭表达质粒。方法 :利用聚合酶链反应 (Polymerasechainreaction ,PCR)扩增H37Rv基因组 4 196 0 7～ 4 19835位的HSP70启动子及调控序列 ,末端引入一个多克隆位点 (Multipleclonesites ,MCS) ,再定向克隆入 pJEM 11的ApaI位点与XbaI位点之间 ,构建pJCH0 2载体 ,并对载体进行酶切鉴定及序列测定。将lhp -esat6融合基因克隆入 pJCH0 2载体 ,评价其在BCG中的表达情况。结果 :HSP70启动子、调控序列及引入的多克隆位点完全正确 ,lhp -esat6基因在BCG中成功表达。 结论 :成功改建穿梭质粒 pJEM11为穿梭表达质粒 pJCH0 2。本研究为构建BCG多价疫苗奠定了基础.
- 陈全朱道银骆旭东蒋英江山
- 关键词：结核分枝杆菌热休克蛋白启动子基因表达
- 结核分枝杆菌DNA疫苗对小鼠结核病的治疗作用
- 目的:该研究拟构建编码结核分枝杆菌H37Rv Ag85B、MPT64以及二者融合基因(AM)的DNA疫苗,建立小鼠结核病模型;探讨上述DNA疫苗对小鼠结核病的治疗作用,IL-12质粒对所构建DNA疫苗的佐剂作用以及DNA...
- 江山
- 关键词：结核分枝杆菌DNA疫苗MPT64AG85B免疫治疗作用基因佐剂
- 小鼠psIL-12质粒抗结核分枝杆菌感染的研究被引量：5
- 2004年
- 目的 观察、评价小鼠白细胞介素 12真核表达质粒psIL 12对结核分枝杆菌感染小鼠细胞因子水平的影响及疗效。方法 结核分枝杆菌H37Rv感染的C5 7BL J6小鼠随机分成生理盐水、pcDNA3.1对照组 ,psIL 12治疗组 ,每组各 6只。感染 4周后分别予以生理盐水、pcDNA3.1、psIL 12 ,第1次治疗后 8周处死检测器官活菌数 ,脏器重量指数 (WI) ,脾淋巴细胞特异性IFN γ、IL 4细胞因子分泌水平 ,并观察肺、脾组织病理改变情况。结果 psIL 12治疗组肺组织活菌数 (每mglog1 0 CFU ml)为7.4 1± 0 .5 0 ,与对照组 (8.15± 0 .37、8.19± 0 .2 9)比较显著降低 (P <0 .0 5 ) ;脾组织荷菌量 (每mglog1 0CFU ml)为 5 .31± 0 .2 1,与对照组 (5 .76± 0 16、5 .88± 0 .2 1)比较显著降低 (P <0 .0 5 )。psIL 12治疗组脾脏重量指数为 0 .5 8± 0 .0 5 ,与对照组 (1.0 2± 0 .0 8、1.10± 0 .0 2 )比较显著降低 (P <0 .0 5 )。脾淋巴细胞IFN γ(pg ml)为 4 78.0± 10 .1,与对照组 (134.5± 15 .7、12 5 .1± 8.2 )比较显著升高 (P <0 .0 5 )。各组间IL 4水平差异无显著性。对照组肺组织病理改变以变质、渗出为主 ,而psIL 12治疗组以增生改变为主。对照组与治疗组间比较脾脏病理改变不明显。结论 psIL 12真核表达质粒对小鼠结核?
- 江山朱道银蒋英骆旭东陈全
- 关键词：小鼠结核分枝杆菌白细胞介素12真核表达质粒
- 结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因疫苗的免疫效果观察被引量：9
- 2003年
- 目的:研究并比较结核分枝杆菌(H37Rv)Ag85B、MPT64DNA.以及两者的融合基因(AM)的免疫原性。方法:雌性C57BL/6小鼠25只,随机分为5组,即A组(PBS)、B组(peDNA3.1)、C组(pcDNA/Ag85B)、D组(pcDNA/MPT64)和E组(pcDNA/AM)。分别于胫前肌注射7.5 g/L利多卡因和质粒混合物(1:4,100μL,含质粒70μg/次),间隔2 wk免疫 1次,共3次。末次免疫后4 wk取血分离血清测定总IgG,同时分离脾淋巴细胞,用PPD刺激后分别做脾淋巴细胞增殖实验(MTT比色法)和测定脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ的水平。结果:Ag85B、MPT64和AM质粒DNA,均能诱导小鼠产生较高水平的PPD特异性IgG。免疫小鼠脾淋巴细胞体外经PPD刺激后,能产生特异性淋巴细胞增殖和分泌IFN-γ。peDNA/AM组IFN-γ的分泌水平明显高于pcDNA/Ag85B和pcDNA/MPT64免疫组(P<0.05)。结论:结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因疫苗,能在小鼠体内诱导特异性细胞和体液免疫。
- 骆旭东朱道银陈全蒋英江山
- 关键词：结核分枝杆菌AG85BMPT64融合基因DNA疫苗
- 结核分枝杆菌lhp基因原核表达载体的构建和表达被引量：5
- 2003年
- 目的 :构建结核分枝杆菌 (MTB)lhp基因原核表达载体并进行表达。方法 :用PCR扩增MTBlhp基因 ,并克隆入pQE30质粒。测序正确后 ,再亚克隆入 pET32a(+)质粒 ,构建pQE30 CFP10和pET32a(+) CFP10重组体。 结果 :以重组体分别转化DH5α和BL2 1(DE3)菌后 ,经IPTG诱导 ,pQE30 CFP10未表达目的蛋白 ;而 pET32a(+) CFP10则表达出Mr 为 2 0 0 0 0左右重组蛋白。SDS PAGE分析显示 ,IPTG诱导 4h重组蛋白的表达量最高。表达蛋白以可溶性非包涵体形式存在于胞质中 ,表达量占全菌蛋白质的 38% ,用Westernblot证实其具有良好的抗原性。经Ni NTA柱纯化 ,获得纯度为 93%的重组蛋白。结论 :成功地构建原核表达载体 pET32a(+) CFP10 ,并获得重组CFP10蛋白 ,为MTB重组抗原的应用奠定了基础。
- 陈全骆旭东蒋英江山朱道银
- 关键词：结核分枝杆菌
- 结核分枝杆菌DNA疫苗对小鼠结核病免疫治疗作用的实验研究被引量：19
- 2005年
- 目的探讨结核分枝杆菌DNA疫苗pcD85B、pcDMPT64以及小鼠白细胞介素12(IL-12)真核表达质粒psIL12对结核分枝杆菌感染的疗效与机制。方法将结核分枝杆菌H37Rv感染的C57BL/J6小鼠100只随机分成生理盐水对照组、pcDNA3.1对照组,psIL12治疗组,pcD85B、pcDMPT64、pcD85B+pcDMPT64、pcD85B+psIL12DNA疫苗治疗组。感染4周后分别给予生理盐水、空质粒、psIL-12及DNA疫苗,第1次治疗后2个月处死小鼠,检测器官荷菌量、脾淋巴细胞特异性γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素4(IL4)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的分泌水平,并于第1次治疗后2个月、5个月观察小鼠肺、脾组织病理改变情况。结果pcD85B治疗组肺组织荷菌量(lg-1CFU/g)为6.99±0.40,比生理盐水对照组(8.15±0.37)、pCDNA3.1对照组(8.19±0.29)显著降低(P<0.01);脾组织荷菌量(lg-1CFU/g,x±s)为5.17±0.33,比生理盐水对照组(5.76±0.16)及空质粒对照组(5.88±0.21)显著降低(P<0.05)。psIL12治疗组的肺(7.41±0.50)、脾(5.31±0.21)荷菌量比对照组显著降低(P<0.05);pcD85B+psIL12治疗组肺、脾荷菌量与pcD85B组比较差别无统计学意义。pcD85B组脾淋巴细胞IFN-γ、TNFα水平比对照组显著升高(P<0.05),各组间IL4水平差异无统计学意义。生理盐水对照组、pCDNA3.1对照组肺组织?
- 江山朱道银骆旭东蒋英陈全
- 关键词：免疫治疗作用DNA疫苗小鼠PCDNA3.1PCDNA3.1AG85B肺组织病理改变
- 结核分枝杆菌Ag85B与MPT64真核共表达质粒的构建及表达
- 2004年
- 目的 :构建结核分枝杆菌Ag85B和MPT6 4编码基因的共表达载体 pBud85B -MPT。 方法 :将结核分枝杆菌Ag85B、MPT6 4基因同时克隆进多启动子共表达载体pBudCE4 .1中 ,得到真核共表达质粒 pBud85B -MPT ;将 pBud85B -MPT转染COS - 7细胞 ,通过RT -PCR方法检测目的基因的表达。结果 :在COS - 7细胞中同时检测到Ag85B、MPT6 4的表达。 结论 :pBud85B -MPT共表达质粒构建成功 ,为进一步研究新型结核病疫苗奠定基础。
- 江山朱道银骆旭东陈全蒋英
- 关键词：结核分枝杆菌AG85B
