杨侃
- 作品数：3 被引量：1H指数：1
- 供职机构：东华大学环境科学与工程学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- miR-505-3p在小鼠胚胎成纤维细胞中抑制可变剪接因子以调控运动神经元存活基因可变剪接
- 2016年
- 目的探究微小RNA 505-3p(miR-505-3p)对于运动神经元存活基因(survival motor neuron gene,SMN)可变剪接的影响。方法利用生物信息学数据库预测miR-505-3p靶基因,构建双荧光素酶报告载体,在小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)中验证靶基因为可变剪接因子(alternative splicing factor,ASF)基因,运用免疫印迹和免疫荧光染色验证miR-505-3p对ASF的抑制效果,利用实时定量PCR技术检测miR-505-3p对具有正常功能的全长SMN(SMN-FL)以及含有毒性的第7号外显子缺失的SMN(SMN-D7)表达量的影响及ASF在其中的作用。结果 miR-505-3P直接结合ASF3'端调控区并抑制ASF mRNA及蛋白表达量,抑制ASF蛋白在细胞核中的表达和分布。过表达miR-505-3p促进SMN-FL向SMND7的转化,而过表达靶基因ASF或者抑制miR-505-3p促进SMN-FL的保留。结论 ASF对SMN基因正常剪接形成SMNFL是必需的,miR-505-3p通过抑制ASF,从而干扰ASF对于SMN可变剪接的调控,导致正常的SMN-FL向毒性的SMN-D7转化。
- 杨侃李晓宁马骁骁李凯周宇荀肖君华
- 关键词：运动神经元存活基因
- miR-505慢病毒表达载体的构建
- 2014年
- 目的:构建携带增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)和miR-505基因的慢病毒载体。方法:采用PCR方法从pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-505表达载体质粒扩增出miR-505 shRNA基因编码区173bp、175、171bp片段,通过限制性酶切、T4DNA连接酶连接,分别将miR-505 shRNA基因插入慢病毒表达载体FUGW与L26Fsy(1.1)GW中,构建成重组载体FUGW-miR-505-3p/5p/nc与Fsy-miR-505-3p/5p/nc。脂质体介导下将慢病毒重组载体转染至HEK 293T细胞,通过EGFP观察转染效率,RT-PCR方法检测miR-505的表达量。结果:荧光显微镜下观测到HEK 293T细胞转染后有较强绿色荧光;RT-PCR显示转染FUGW-miR-505-3p/5p与Fsy-miR-505-3p/5p的HEK 293T细胞中对应miR-505-3p/5p明显升高。结论:成功构建带有EGFP和miR-505-3p/5p/nc shRNA基因的慢病毒表达载体。
- 马骁骁杨侃晁天柱薛慧慧邓倩云常雪莹周宇荀
- 关键词：慢病毒载体瞬时转染RT-PCR
- 一种优化小鼠成纤维细胞中自噬小体示踪的方法被引量：1
- 2017年
- 目的为了提高对自噬小体示踪的精确度和清晰度,全面展示细胞自噬相关进程,优化基于绿色荧光蛋白-微管相关蛋白1轻链3β(GFP-LC3β)标记物的自噬小体示踪方法。方法组织块贴壁法原代培养小鼠耳成纤维细胞,脂质体转染过表达GFP-LC3β;GFP-LC3β充分表达后给予药物刺激以激活或阻断细胞自噬通路,然后进行免疫荧光染色。对染色操作进行优化:首先,延长多聚甲醛的固定细胞时间(从15min延长至45min);其次,提高Triton X-100处理时间,除第一次和最后一次使用PBS润洗,其余每一次使用的PBS都添加0.2%Triton X-100;最后,提升抗体稀释液中BSA和Triton X-100含量,BSA从3%提升至5%,TritonX-100的含量从0.1%提升至0.2%。结果拍照后统计自噬小体发现,新方法更加准确地标记GFP-LC3β指示物,自噬激活条件下示踪准确度显著提升(达4.2倍);新方法更加清晰地呈现自噬小体的形态和胞内分布,将自噬小体示踪的清晰度显著提升(达2.5倍);新方法还能使用不同荧光通道,同时标记其他自噬相关基因。结论本研究提供的一种优化小鼠成纤维细胞中自噬小体示踪的方法将为全面展示细胞自噬进程、深入了解细胞自噬相关机制提供有力的技术支持。
- 杨侃李晓宁OmaribaGideon李凯周宇荀肖君华
- 关键词：原代培养
