李鹏飞
- 作品数：10 被引量：23H指数：2
- 供职机构：辽宁医学院更多>>
- 发文基金：辽宁省教育厅科学基金国家自然科学基金辽宁省教育厅资助项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学农业科学更多>>
- 中蜂囊状幼虫病毒RT-PCR检测方法的建立被引量：15
- 2010年
- 目的建立中蜂囊状幼虫病毒RT-PCR检测方法。方法参照已发表的中蜂囊状幼虫病毒(CSBV)基因序列,针对其结构蛋白基因设计1对特异性引物,提取感染CSBV的囊状幼虫RNA,反转录为cDNA,以其为模板,进行PCR扩增,对检测方法进行优化,验证该方法的特异性及敏感性,并对31份临床样品进行检测。结果所建立的CSBVRT-PCR检测方法特异性和敏感性良好,以含CSBV结构蛋白基因的重组质粒为模板,最低可检出10pgDNA。临床症状诊断和电镜观察均为阴性的22份样品经RT-PCR检测,有2份扩增出目的条带。结论已建立了中蜂囊状幼虫病毒RT-PCR检测方法,为CSBV检测、流行病学调查及动物模型的建立奠定了基础。
- 马鸣潇李明袁春颖李鹏飞张轶博苏玉虹曲祖乙
- 关键词：反转录聚合酶链式反应特异性敏感性
- 人骨髓间充质干细胞体外诱导分化为多巴胺能神经元被引量：1
- 2012年
- 目的:联合应用不同生长因子与血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)体外诱导人骨髓间充质干细胞(hBMSCs),探讨体外hBMSCs向神经元和多巴胺能神经元分化的潜能。方法:获得正常人BMSCs并纯化,先用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮细胞生长因子(EGF)进行预诱导,再用胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)联合诱导第3代生长良好的BMSCs向神经元分化。利用倒置显微镜观察BMSCs分化过程中细胞形态的变化;通过RT-PCR方法检测诱导前后神经元特异性烯醇化酶(NSE)、多巴胺能神经元特异性标记物酪氨酸羟化酶(TH)的表达情况。结果:不同浓度的AngⅡ诱导2周后,应用倒置显微镜观察到各组BMSCs具有典型神经元样的细胞形态,大多呈双极、多极和锥形;RT-PCR方法检测显示NSE、TH的基因表达量在诱导组较其对照组有显著性增加(P<0.05)。结论:多种生长因子联合AngⅡ可以在体外诱导人BMSCs分化为多巴胺能神经元样细胞。
- 张蕾金辉李伟伟田力李鹏飞
- 关键词：骨髓间充质干细胞
- 人端粒酶启动子(hTERTp)真核表达载体的构建
- 2008年
- 目的克隆人端粒酶催化亚单位(hTERT)的启动子,构建真核表达载体pEGFP-hTERT。方法以人类基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增hTERT上游序列长约1135 bp的启动子片段,克隆入绿色荧光蛋白GFP的基因上游,测序鉴定。结果DNA测序结果与GenBank中hTERT启动子DNA序列完全一致,片段长度为1135 bp。结论人端粒酶启动子的真核表达载体pEGFP-hTERT构建成功,为hTERTp调控元件用于肿瘤靶向性基因治疗奠定了基础。
- 田力李伟伟李鹏飞张蕾
- 关键词：荧光蛋白肿瘤
- 端粒酶启动子突变对EGFP启动效率影响
- 2010年
- 目的观察人端粒酶催化亚单位(hTERT)的突变启动子启动增强型绿色荧光蛋白(EGFP)发光强度的变化情况。方法应用PCR引入突变方法获得hTERT上游序列长约300bp的启动子片段,包括单增强子(E-box)突变序列(2个);双E-box突变序列;单转录因子特异蛋白1(Sp1)结合位点突变序列(5个);Sp1结合位点全部(Sp1-5)突变序列,分别克隆入无启动子的绿色荧光蛋白EGFP的基因上游,稳转入SW579细胞中,观察细胞EGFP的发光强度。结果除了约-110bp的单Sp1突变对EGFP的启动效率影响不大之外,任何一种E-box或Sp1突变的启动子均显示启动效率不同程度的下降,其中双E-box突变的启动子和5个SP1结合位点均突变的启动子启动绿色荧光蛋白的表达强度明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结论转染人端粒酶启动子突变基因,能够抑制SW579细胞EGFP的发光效率,证明人端粒酶启动子的E-box序列、SP1结合序列对启动子的启动效率密切相关,为hTERTp调控元件用于肿瘤靶向性基因治疗提供了基础依据。
- 张蕾田力李伟伟李鹏飞
- 关键词：绿色荧光蛋白
- 人甲状腺鳞癌细胞中端粒酶启动子功能分析被引量：1
- 2011年
- 目的观察不同长度的人端粒酶催化亚单位(hTERT)的启动子对启动增强型绿色荧光蛋白(EGFP)能力的差异,评价启动子启动功能与长度的关系。方法克隆4段不同长度的端粒酶基因起始位点(ATG)上游序列长约2 068、1 135、333和142 bp的启动子片段,通过观察EGFP的荧光强度,确定启动效率。结果显微镜观察荧光亮度及荧光分光光度计检测荧光强度随着启动子长度的缩短而减弱,荧光强度由高至低依次为8.56,7.81,6.88,3.62。结论人端粒酶的表达强度及端粒酶的活性变化与其启动子的长度有关,而肿瘤细胞的端粒酶表达相对增强,可通过下调启动子活性,为肿瘤的靶向性基因治疗提供新思路。
- 张蕾金辉田力李伟伟李鹏飞
- 关键词：荧光蛋白SW579
- 端粒酶上调与甲状腺鳞癌细胞增殖关系被引量：1
- 2010年
- 目的上调甲状腺鳞癌细胞(SW579)的人端粒酶催化亚单位(hTERT)表达,观察细胞增殖情况,检测端粒酶活性变化。方法应用酶切方法获得hTERT序列全长3 453 bp的cDNA片段,克隆入荧光蛋白质粒(pEGFP-N1),构建真核表达载体pEGFP-hTERT,转染SW579细胞中,观察细胞生长状态的变化,检测端粒酶活性。结果稳定转染pEGFP-hTERT的SW579细胞的增殖率为148%,比非转染组增加48%,比空质粒组增加45%,差异均有统计学意义(P<0.01);重组质粒转染组G1、S、G2/M期细胞比例分别为68.05%,27.66%和10.45%,与非转染组和空质粒组比较,差异均有统计学意义(P<0.01,P<0.05);重组质粒转染组增殖指数(PI)为38.11,明显高于空质粒组的14.22和非转染组的13.60,其端粒酶活性检测梯状条带增加,活性增强。结论上调人端粒酶表达,能够促进SW579细胞增殖。
- 张蕾田力李伟伟李鹏飞
- 关键词：端粒酶增殖
- 卵泡抑素诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞被引量：2
- 2009年
- 本实验观察了卵泡抑素(follistatin)对骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经细胞分化的影响。利用Percoll密度梯度离心法及贴壁筛选法分离培养和扩增成人的BMSCs,通过流式细胞术分析鉴定BMSCs的纯度,用follistatin诱导第三代生长良好的MSCs向神经元转化,观察分化过程中细胞形态的变化,利用RT-PCR方法检测诱导前后BMSCs的神经元特异性烯醇化酶(NSE)和神经干细胞标记物巢蛋白(Nestin)的表达情况。结果显示:流式分析获得了纯度较高的BMSCs,细胞表达CD29、CD44、CD106和CD166,不表达CD34和CD45。诱导10d后,细胞呈现双极、多极和锥体形的典型神经元细胞形态,并且在mRNA水平证明诱导分化后的细胞与对照组比较NSE和Nestin的表达增加(P<0.05)。上述结果表明follistatin可以在体外诱导人的BMSCs分化为神经样细胞。
- 李伟伟张蕾田力李鹏飞
- 关键词：骨髓间充质干细胞卵泡抑素分化神经元样细胞
- 人生长激素释放激素变异受体1型基因绿色荧光蛋白真核表达载体1的构建及体外表达被引量：1
- 2009年
- 目的构建人生长激素释放激素变异受体1型(GHRHR-SVT1)基因绿色荧光蛋白真核表达载体1(pEG-FP-N1)并在鼠成纤维细胞株NIH-3T3细胞中的表达。方法GHRHR-SVT1基因是由人胃癌细胞株AGS中扩增出的DNA片段,克隆入真核表达载体pEGFP-N1中,用高效转染试剂将pEGFP-N1/GHRHR-SVT1转染NIH-3T3细胞,NIH-3T3细胞分3组:非转染组(对照组),只加转染试剂不加质粒;转染空质粒组(pEGFP-N1组),加转染试剂与空质粒;重组质粒转染组(pEGFP-N1/GHRHR-SVT1组),加转染试剂与重组质粒。采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法和流式细胞仪检测各组转染后各组NIH-3T3细胞的生长情况。结果(1)pGEFP-N1/GHRHR-SVT1经限制性内切酶XhoⅠ和Bam HⅠ双酶切产生约1 080 bp和4 700 bp 2条带。(2)构建的GHRHR-SVT1cDNA序列与GHRHR-SVT1原始序列(AF-282259)进行对比,第54位碱基突变(A突变为T),为无义突变。(3)重组质粒转染组NIH-3T3细胞增殖率明显高于对照组(P<0.01)。(4)重组质粒转染组NIH-3T3细胞增殖指数明显高于对照组(P<0.01)。结论在适当浓度GHRH(10μmol/L)的培养基中,GHRHR-SVT1能够促进NIH-3T3细胞增殖,并为肿瘤的治疗提供新的思路。
- 田力张蕾李伟伟李鹏飞
- 功能性猪α干扰素基因的表达及活性检测被引量：1
- 2010年
- [目的]检测克隆猪α干扰素基因(IFN-α基因)在毕赤酵母中的表达。[方法]经植物血凝素(PHA)诱导后,提取猪外周血淋巴细胞,并用RT-PCR方法获得IFN-α基因,将该基因与真核表达质粒pPIC9K连接,并电转入毕赤酵母GS115菌中,经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE电泳检测IFN-α蛋白表达,Western-blot分析IFN-α蛋白活性。[结果]重组转化菌株经甲醇诱导后能表达相对分子质量约为19kD的蛋白质,该蛋白质能与相应抗体产生免疫反应。[结论]实现了猪功能性IFN-α基因表在毕赤酵母中表达,为进一步探讨IFN-α的生物学活性研究奠定了基础。
- 张蕾李鹏飞李伟伟马鸣潇
- 关键词：毕赤酵母真核表达活性检测
- 猪干扰素α基因的克隆与真核表达被引量：1
- 2010年
- 目的克隆猪干扰素α(IFNα)基因,并在毕赤酵母中进行表达。方法用植物血凝素诱导猪外周血中的淋巴细胞,Trizol试剂提取总RNA,经RT-PCR扩增猪IFNα基因,将其克隆至pPIC9K载体中,构建重组真核表达质粒pPIC9K-IFNα,经PCR、酶切及测序鉴定正确后,电转化至毕赤酵母GS115中。筛选阳性菌株,经甲醇诱导表达后,进行SDS-PAGE及Westernblot分析。结果RT-PCR扩增获得521bp的猪IFNα基因;所构建的重组表达质粒经PCR、酶切及测序鉴定正确;表达的目的蛋白相对分子质量约为19000,可溶性蛋白约占菌体总蛋白的13%;该蛋白能与相应抗体产生特异免疫反应。结论已成功克隆并在毕赤酵母中表达了猪IFNα基因,为进一步研究其生物学性状奠定了基础。
- 李鹏飞李明程健李伟伟马鸣潇张蕾
- 关键词：克隆真核表达毕赤酵母
