胡亮
- 作品数：5 被引量：7H指数：2
- 供职机构：辽宁医学院附属第一医院更多>>
- 发文基金：辽宁省高校创新团队支持计划辽宁省自然科学基金更多>>
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- 构建携带VEGF_(121)-FLAG和hrGFP-1基因腺病毒表达载体在骨髓基质干细胞中的表达(英文)被引量：1
- 2010年
- 背景:血管内皮生长因子具有促进血管生成的作用,在骨缺损的治疗研究中运用较多,但其异构体VEGF121的研究较少。目的:构建携带VEGF121-FLAG和hrGFP-1基因的腺病毒表达载体并观测其在骨髓基质干细胞中的表达。方法:以pTG19T-VEGF121为模板利用PCR技术突变VEGF121基因以去除VEGF121基因中终止密码子,之后在基因序列前后分别加入NotⅠ和XhoⅠ酶切位点,并将得到的基因亚克隆至pMD19-T质粒上,双酶切pMD19-T-VEGF121和pShuttle-CMV-IRES-hrGFP-1质粒,凝胶回收小片段和大片段,后进行连接反应,完成穿梭质粒的构建。重组病毒物理滴度测定后感染骨髓基质干细胞,在荧光显微镜下观察荧光强度。结果与结论:经酶切鉴定及基因测序证实重组腺病毒质粒构建成功,荧光显微镜下观察表明,感染重组腺病毒的骨髓基质干细胞有明显的绿色荧光表达。可见构建的携带VEGF121-FLAG和hrGFP-1基因的腺病毒表达载体可在真核细胞表达,有可能用于缺血性疾患的基因治疗。
- 刘丹平李谌胡亮王国贤
- 关键词：骨缺损腺病毒载体绿色荧光蛋白
- 携带低氧诱导因子1α^(mu)和人源化海肾绿色荧光蛋白双基因真核表达载体构建及其在HEK293A细胞中的表达被引量：1
- 2010年
- 背景:低氧诱导因子1能够调控多种基因共同表达,在骨缺损部位可诱导成熟的血管生成,为各种细胞的成骨分化和成骨活动提供营养支持和代谢保证,促进骨愈合,但其真核表达载体的构建及表达却少见报道。目的:实验拟构建携带低氧诱导因子1αmu(hypoxia inducible factor 1 alpha,HIF-1α)目的蛋白和人源化海肾绿色荧光蛋白(human renilla reniformis green fluorescent protein,hrGFP)的双基因真核表达载体,并将其转染HEK293A细胞,观测其在细胞中的表达。方法:利用PCR技术定点突变目的基因供体质粒pCMV6-XL5-HIF1α携带的人HIF1α基因编码区的第402位、564位和803位氨基酸以及去掉其终止密码子,之后在基因序列前后添加新的酶切位点NotⅠ和PvuⅠ,酶切、测序检测突变情况,将正确突变的HIF1αmu定向连入腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV-IRES-hrGFP-1中。经测序鉴定、PmeⅠ酶切线性化后转化BJ5183-AD-1电感受态细胞,通过hrGFP基因荧光表达检测转染情况。结果与结论:经基因测序证实,HIF-1α基因编码区的第402位、564位和803位氨基酸均定点突变成丙氨酸,终止密码子成功去除。经酶切鉴定及测序证实,重组腺病毒表达载体构建成功。荧光显微镜下观察表明,感染重组腺病毒的HEK293A细胞内有大量绿色荧光表达证实通过Lipofectamine 2000途径可使得重组腺病毒载体成功转染HEK293A细胞。
- 张正李谌胡亮刘丹平
- 关键词：低氧诱导因子1Α腺病毒载体绿色荧光蛋白
- 常氧条件下同时表达突变型低氧诱导因子1α目的蛋白和人源化绿色荧光蛋白报告分子腺病毒真核表达载体的构建(英文)被引量：4
- 2010年
- 背景:低氧诱导因子1能够调控多种基因共同表达,在骨缺损部位可诱导生理功能完整的新血管生成。目的:构建能够同时表达突变型低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1 alpha,HIF-1α)目的蛋白和人源化绿色荧光蛋白(human renilla reniformis green fluorescent protein,hrGFP)报告分子的新型腺病毒真核细胞表达载体。方法:对目的基因供体质粒pCMV6-XL5-HIF1α携带的人低氧诱导因子1α基因进行测序和对其序列内部限制性内酶识别位点进行分析,利用PCR(poly-merase chain reaction,PCR)技术定点突变低氧诱导因子1α基因编码区的第402位、564位和803位氨基酸,酶切、测序检测突变情况,将正确突变后的低氧诱导因子1α基因(突变mutagenesis,突变后的HIF-1α基因写作HIF-1αmu)定向连入腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV-IRES-hrGFP-1中。携带HIF-1αmu基因的重组腺病毒穿梭载体经测序鉴定、PmeⅠ酶切线性化后转化BJ5183-AD-1电感受态细胞,利用细菌内同源重组机制将HIF-1αmu和人源化绿色荧光蛋白基因连同其顺势表达元件重组入腺病毒基因组质粒,通过PacⅠ酶切及测序鉴定获得重组体。结果与结论:经基因测序证实,HIF-1α基因编码区的第402位、564位和803位氨基酸均定点突变成丙氨酸。经酶切鉴定及测序证实,重组腺病毒表达载体构建成功。结果表明,成功构建了新型重组腺病毒突变型真核细胞表达载体pAd-HIF1αmu-IRES-hrGFP-1。
- 刘丹平王国贤胡亮李谌
- 关键词：低氧诱导因子1Α重组腺病毒载体绿色荧光蛋白
- 腺病毒穿梭质粒pShuttle CMV-^+VEGF_(121)-IRES-hrGFP-1的构建和鉴定被引量：2
- 2009年
- 目的构建腺病毒穿梭质粒pShuttle CMV-^+VEGF_(121)-IRES-hrGFP-1,为构建表达具有抗原表位标记的血管内皮生长因子121(vascular endothelial growth factor 121,VEGF_(121)),并同时表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)报告分子的腺病毒真核细胞表达载体打下基础。方法对目的基因供体质粒pTG19T-VEGF_(121)携带的VEGF_(121)基因测序和序列内部存在的限制性内切酶识别位点进行分析,利用PCR(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术对pTG19T-VEGF_(121)携带的VEGF_(121)基因突变,以去除翻译终止密码子后的基因序列并在序列前后分别添加新的NotI和XhoI酶切位点。将突变后的VEGF_(121)基因(^+VEGF_(121))定向连入腺病毒穿梭质粒pShuttle CMV-IRES-hrGFP-1,通过电泳和测序鉴定获得的重组质粒。结果重组质粒经电泳和测序鉴定为正确克隆。结论成功构建了pShuttle CMV-^+VEGF_(121)-IRES-hrGFP-1。
- 胡亮李谌刘丹平
- 突变型低氧诱导因子-1α腺病毒载体的构建及常氧表达被引量：2
- 2011年
- 目的为了在常氧条件下观察低氧诱导因子-1α（HIF-1α）在骨缺损部位促新血管生成作用，构建能够同时表达突变型HIF-1仅和人源化绿色荧光蛋白（hrGFP）的腺病毒载体并检测其在兔骨髓间充质干细胞（MSCs）中的表达。方法利用聚合酶链式反应（PCR）定点突变人HIF-1α编码区（CDS）第402、564和803位氨基酸，将突变后HIF-1α和hrGFP重组入pAdEasy-1系统，包装病毒并测定滴度。以感染复数（MOI）=100将腺病毒转染MSCs，逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）和Westernblot方法检测转染细胞中HIF-1αmRNA和蛋白表达。结果（1）第402、564和803位氨基酸均定点突变为丙氨酸。（2）A、B两组HIF-10tmRNA表达量明显高于C、D两组，差异有统计学意义（P〈0．01）；A组HIF-1α蛋白表达量明显高于其他3组，差异有统计学意义（P〈0．01）。结论（1）腺病毒载体Ad—HIF-1α mu-IRES—hrGFP-1构建成功。（2）突变后HIF-1α基因能够在常氧条件下大量且高效表达。
- 李谌靳云龙胡亮刘丹平
- 关键词：低氧诱导因子-1Α重组腺病毒载体骨髓间充质干细胞
