该研究以泌乳中期的奶牛乳腺上皮细胞为模型,探索Pten基因的表达与奶牛乳腺发育和泌乳之间的关系,目的在于揭示Pten基因在奶牛乳腺中的调节作用,为动物乳腺发育和泌乳调节机制的研究提供基础资料。该研究以中国荷斯坦奶牛作为实验动物,应用荧光定量q RT-PCR、Westernblotting和免疫组织化学技术,对奶牛不同发育阶段及不同乳品质的乳腺组织中Pten m RNA和蛋白质的相对表达量进行检测;以体外培养的泌乳中期奶牛乳腺上皮细胞为研究对象,构建重组质粒p GCMV-PtenIRES-EGFP,对细胞进行瞬时转染,进行Pten基因过表达实验;应用RNA干扰的方法用Pten si RNA瞬时转染细胞,进行Pten基因抑制实验。分别用相关试剂盒检测Pten基因过表达和抑制之后细胞?-酪蛋白、甘油三酯以及乳糖分泌的情况,为了检测Pten基因对奶牛乳腺上皮细胞活力和增殖能力的影响,分别应用CASY-TT细胞分析仪和流式细胞仪检测细胞活性和细胞周期,采用荧光定量q RT-PCR和Western blotting技术,在m RNA和蛋白水平检测与泌乳相关的信号通路基因的表达变化;同时,添加外源性催乳素和葡萄糖培养细胞,检测培养液上清中?-酪蛋白、甘油三酯和乳糖的浓度,以及Pten基因的表达量变化,从而探索Pten基因在催乳素诱导的葡萄糖转化生成乳糖过程中的作用。研究结果表明,泌乳期Pten基因表达量显著低于干乳期。与泌乳期低乳品质奶牛乳腺相比,泌乳期高乳品质的奶牛乳腺组织中Pten m RNA和蛋白表达水平分别降低了30%和40%;Pten基因过表达可抑制奶牛乳腺上皮细胞的活力、增殖能力以及?-酪蛋白、甘油三酯和乳糖的分泌量(<0.05),使奶牛乳腺上皮细胞中MAPK、Cyclin D1、AKT、m TOR、S6K1、STAT5、SREBP1、PPAR?、PRLR、GLUT1的表达下调(<0.05),并上调4EBP1的表达水平(<0.05);Pten基因抑制实验表现出相反的结果;而Pten基因的过表达和抑制对ELF5的�
为确定microRNA-152(miR-152)对奶牛乳腺上皮细胞中乳蛋白合成的影响,本试验应用脂质体转染技术,改变miR-152在奶牛乳腺上皮细胞的表达量。采用实时荧光定量PCR、Western blotting、细胞活力分析等技术探索miR-152对奶牛乳腺上皮细胞增殖及泌乳功能的影响。结果显示,miR-152沉默,细胞因子信号传导抑制蛋白3(suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)表达增强,信号转导通路分子磷酸化信号转导与转录激活因子5(phospho-signal transducer and activator of transcription 5,p-STAT5)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素蛋白(phospho-mammalian target of rapamycin,p-mTOR)、核糖体S6激酶1(ribosomal protein S6kinase 1,S6K1)、细胞周期蛋白D1(cyclinD1)表达减弱,细胞增殖能力减弱,β-酪蛋白分泌减少。研究结果表明,miR-152在奶牛乳腺上皮细胞调控的靶基因是SOCS3,通过抑制其表达而发挥作用。miR-152可通过调控p-STAT5、p-mTOR、S6K1、cyclinD1信号转导而促进乳蛋白的合成和乳腺上皮细胞增殖。
