殷冬冬
- 作品数：24 被引量：104H指数：7
- 供职机构：安徽农业大学动物科技学院更多>>
- 发文基金：安徽省自然科学基金国家自然科学基金安徽省教育厅重点科研项目更多>>
- 相关领域：农业科学医药卫生生物学更多>>
- 口疮病毒VEGF基因的原核表达及亚细胞定位被引量：4
- 2017年
- 为了对口疮病毒(ORFV)VEGF基因进行原核表达和亚细胞定位研究,PCR扩增VEGF基因,并将其分别克隆至原核表达载体p ET-32a(+)和真核表达载体p EGFP-C3中。将原核表达重组质粒转化至E.coli Rosseta感受态细胞中,经IPTG诱导表达目的蛋白。将表达产物纯化后免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体血清,并利用琼脂扩散试验检测其效价。将真核表达重组质粒转染BHK21细胞,利用激光共聚焦观察VEGF蛋白在BHK21细胞中的亚细胞定位。结果表明:VEGF蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达,主要以包涵体形式表达,蛋白分子质量大小约为33 ku。Western-blot结果表明,VEGF蛋白具有良好的反应原性,制备的多克隆抗体效价达1∶8。VEGF蛋白在转染BHK21细胞后主要在细胞质中表达,且能够与制备的多抗血清反应。本研究为进一步研究该蛋白的功能奠定了一定的基础。
- 殷冬冬杨侃侃白彩霞赵玉洁潘飞徐燕华梅跃辉苏莉钟灵毓崔佣楸张子军祁克宗王桂军王勇
- 关键词：VEGF基因原核表达亚细胞定位
- 抗羊口疮病毒囊膜蛋白B2L小鼠多克隆抗体的制备和应用被引量：8
- 2018年
- 目的获取羊口疮病毒(ORFV)囊膜蛋白B2L并制备鼠抗B2L蛋白多克隆抗体。方法采用PCR扩增获得B2L基因,并将其分别克隆至原核表达载体p ET-32a和真核表达载体p3×FLAG-CMV-14。两个重组表达载体均经过鉴定,重组原核表达载体使用BL21大肠杆菌表达,异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达目的蛋白。通过Tris-尿素溶液洗去非目的蛋白,Western blot法鉴定。将定量的纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,制备鼠抗ORFV B2L多克隆抗体。将真核表达重组质粒p3×FLAG-B2L转染Vero细胞、BHK-21细胞,使用间接免疫荧光法(IFA)对抗B2L蛋白的多克隆抗体鉴定,并应用于免疫组织化学染色检测患病羊唇部组织ORFV的表达。结果 Western blot法确定了制备的B2L蛋白的特异性; IFA结果表明制备的小鼠抗B2L多克隆抗体有特异性和反应原性,免疫组织化学染色法结果表明该抗体可以检测出患病羊唇部组织的ORFV。结论成功制备了特异性的小鼠抗B2L多克隆抗体。
- 周祺顾香雪许泽军黄荣黄军生李浩然李涛周晓雅周晓雅殷冬冬王桂军
- 关键词：羊口疮病毒多克隆抗体
- 鸭坦布苏病毒E蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备被引量：1
- 2016年
- 目的用RT-PCR技术扩增鸭坦布苏病毒(DTMUV)AH-F10株E基因,并克隆至pET32a(+)载体,构建重组表达质粒pET32a-E,表达E蛋白。方法重组表达质粒转化感受态细胞BL21(DE3),经IPTG诱导后,获得含6个His标签的融合蛋白,大小约54kDa。表达的蛋白以包涵体形式存在。对目的蛋白进行纯化,用纯化的E蛋白免疫Balb/c小鼠,制备多克隆抗体血清。结果SDS-PAGE和Western blot试验结果表明E基因在大肠埃希菌中成功表达,并能与抗DTMUV多克隆抗体产生特异性反应,具有良好的反应原性。间接免疫荧光试验表明免疫小鼠后获得的多克隆抗体能与DTMUV反应。结论本研究为DTMUV新型疫苗和诊断试剂盒的进一步研究奠定了基础。
- 王勇殷冬冬宫晓华王瑞许漩唐井玉兰梦蝶王桂军
- 关键词：E蛋白原核表达多克隆抗体
- 一例松鼠猴感染乳酸明串珠菌的诊断报告
- 2017年
- 2014年9月,合肥野生动物园发生一起松鼠猴感染乳酸明串珠菌的病例。病猴出现咳嗽,流鼻涕,发热等症状。病程较快,观察到上述症状后即死亡。剖检时发现肺脏瘀血,肠壁有大小均一的黑点。从病死猴的肝脏分离到一株细菌,纯分后发现菌落形态为细小灰白色,表面光滑,呈透镜状,边缘整齐无皱褶。革兰氏染色后镜检发现为革兰氏阳性球菌,经过细菌16S rRNA PCR扩增和测序比对,确诊为乳酸明串珠菌感染。
- 张志忠王瑞聂睿郭浩殷冬冬王桂军
- 关键词：松鼠猴
- 表达羊口疮病毒B2L基因“自杀性”DNA疫苗的构建及鉴定
- 根据羊口疮病毒AH-GY13株B2L基因序列,设计特异性引物,两端分别添加BamHⅠ和XmaⅠ酶切位点。提取该毒株的DNA并以其为模板,扩增出B2L基因,再将该基因克隆至'自杀性'DNA疫苗载体pSCA 1中,构建重组真...
- 白彩霞殷冬冬潘飞蒋书东方富贵李福宝王勇
- 关键词：羊口疮病毒B2L基因
- 文献传递
- 鸭坦布苏病毒囊膜糖蛋白结构域3(ED3)单克隆抗体的制备及其中和活性分析被引量：2
- 2022年
- 目的以纯化的重组鸭坦布苏病毒(DTMUV)囊膜糖蛋白结构域3(ED3)蛋白作为免疫原,制备ED3蛋白的单克隆抗体并研究其中和活性。方法利用反转录PCR扩增DTMUV AH-F10株ED3基因,构建重组表达载体pET32a-ED3并转化至表达菌株Rosetta,诱导表达后利用镍柱亲和层析法纯化目的蛋白。以纯化的目的蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫后小鼠的脾细胞与Sp2/0细胞进行细胞融合,采取有限稀释法筛选杂交瘤细胞并大量制备单克隆抗体。利用Western blot法、间接免疫荧光法、ELISA及分型试剂盒对单克隆抗体进行鉴定并通过病毒中和试验检测抗体中和效价。结果成功表达DTMUV ED3蛋白,并制备3株ED3蛋白的鼠源单克隆抗体B9D10C7、B9D7B8G10、B9D7B8F11,其亚型分别为IgG1、IgG2a、IgG2b,腹水间接ELISA检测抗体效价均达到1∶51200,且能够识别DTMUV的E蛋白,具有一定的中和活性。结论获得3株特异性强、敏感性高的DTMUV ED3的单克隆抗体。
- 张淼吕炫张冲阚莹王若洁于胜祖卢奇祝萌方天刘丹朱英奇曹守林王蓓王蓓殷冬冬王桂军
- 关键词：原核表达单克隆抗体
- 羊口疮病毒安徽株的分离鉴定及其B2L和F1L基因的序列分析
- 为确定安徽肥东某山羊场发生的疑似羊口疮(orf)的病原,利用MDBK细胞从送检的病羊唇部痂皮中分离获得病毒,通过PCR鉴定确定病原为羊口疮病毒(ORFV),并将其命名为ORFV/AH-FD/2016/China株。然后对...
- 殷冬冬白彩霞潘飞蒋书东方富贵李福宝王勇
- 关键词：羊口疮病毒B2L基因
- 文献传递
- 羊口疮病毒F1L基因的原核表达与鉴定
- 本研究设计一对特异性引物扩增羊口疮病毒F1L基因序列,并将其克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,获得重组质粒pGEX-6P-1-F1L,将重组质粒转化到Rosetta感受态细胞中,经IPTG诱导表达,通过SDS-PAG...
- 白彩霞殷冬冬潘飞蒋书东方富贵李福宝王勇
- 关键词：羊口疮病毒原核表达
- 文献传递
- 鸭抗病毒蛋白(viperin)在转染的BHK-21细胞表达并抑制鸭坦布苏病毒出芽被引量：4
- 2019年
- 目的探索鸭抗病毒白(viperin)对鸭坦布苏病毒(DTMUV)增殖的影响。方法使用生物学信息学方法分析鸭viperin基因,构建系统发育树。构建原核表达质粒pGEX-6P-viperin和真核表达质粒pEGFP-N1-viperin,分别转化Rosseta感受态细胞和转染BHK-21细胞。用DTMUV分别感染真核表达质粒和空载体质粒的BHK-21细胞,利用实时荧光定量PCR检测细胞沉淀和上清中DTMUV的含量,利用质谱的方法鉴定增强型绿色荧光蛋白(EGFP)单克隆抗体捕获的结合蛋白。结果鸭viperin基因与其他种属viperin基因有显著差异。鸭viperin蛋白能成功在BHK-21细胞表达,鸭viperin抑制DTMUV在BHK-21细胞中的出芽。质谱分析结果显示转染真核表达质粒的细胞中可能存在6种影响抑制DTMUV增殖、出芽的蛋白。结论鸭viperin蛋白可在BHK-21细胞表达,且能抑制鸭坦布苏病毒出芽。
- 周祺顾香雪许泽军黄荣殷冬冬殷冬冬吕炫王桂军
- 关键词：质谱分析法
- 口疮病毒020基因的克隆、表达及多抗制备被引量：6
- 2017年
- 羊口疮是由口疮病毒(orf virus,ORFV)引起的接触性、嗜上皮性的传染病。020基因是该病毒重要的酶活力调节蛋白。根据Gen Bank中020基因的序列设计引物,从ORFV-F10株感染的病料中提取DNA,PCR扩增获得目的基因。然后将其亚克隆至p ET-32a(+)原核表达载体,构建重组表达质粒p ET-32a-ORF-020。鉴定正确后转化BL21感受态细胞,进行IPTG诱导表达。表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析。最后将纯化的020蛋白免疫BALB/c雌鼠,制备多抗血清。SDS-PAGE结果表明,ORFV 020基因在体外获得正确表达,大小约37 k Da。Western-blot结果表明,制备的多抗血清能够与020蛋白发生特异性反应具有良好的反应原性。
- 王勇赵玉洁杨侃侃殷冬冬白彩霞潘飞梅跃辉颜秀梅王君徐前明蒋书东
- 关键词：羊口疮病毒克隆原核表达多克隆抗体
