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汉滩病毒VLP的构建及其生物学特性的研究被引量：1: 2015年; 汉滩病毒是一种单负链RNA病毒,在我国主要引起以发热、出血、急性肾功能损害和免疫功能紊乱为主要特征的肾综合征出血热(HFRS),临床治疗尚无特效治疗药物,主要依靠灭活疫苗进行预防,但其诱导机体产生病毒中和抗体滴度较低,诱导细胞免疫反应能力差。病毒样颗粒(virus like particles,VLP)具有病毒天然蛋白成分和构象,但不含病毒核酸,是理想的候选疫苗。将表达汉滩病毒包膜糖蛋白Gn和Gc的M片段与含有表达汉滩病毒核蛋白的S片段的载体在哺乳动物细胞中共表达,包装出汉滩病毒VLP,对包装出的VLP进行初步纯化和生物学特性的鉴定。; 应旗康张晓晓王芳冯伟张尧吴兴安刘梓愉; 关键词：汉滩病毒 VLP 疫苗

带有小鼠CD40L基因的汉滩病毒糖蛋白表达载体的构建: 2017年; 目的:构建汉滩病毒包膜糖蛋白基因的真核表达载体,并加入可增强免疫应答效应的细胞因子CD40L基因,检测其可否在真核细胞中表达。方法与结果:参照GenBank中汉滩病毒M基因和小鼠CD40L的全基因序列设计引物,通过聚合酶链反应(PCR)获得M和CD40L基因片段,将其与pCI-neo载体相连,测序证实该载体构建成功后,将此真核表达载体以脂质体转染法转染至哺乳动物细胞CHO-K1中,利用间接免疫荧光法(IFA)检测发现M基因和CD40L基因可以同时表达于CHO-K1细胞中。结论:构建了带有CD40L基因的汉滩病毒包膜糖蛋白重组质粒并获得表达,为深入研究汉滩病毒感染后包膜糖蛋白引起的特异性免疫应答规律奠定了实验基础。; 冯伟张尧张晓晓应旗康刘梓谕吴兴安王芳; 关键词：汉滩病毒包膜糖蛋白 CD40L

汉滩病毒感染小鼠腹腔巨噬细胞模型的建立: 2017年; 目的:建立汉滩病毒感染的小鼠腹腔巨噬细胞模型。方法:PBS灌洗6~8周龄C57BL/6小鼠腹腔,分离获取小鼠腹腔巨噬细胞后,以100 TCID50汉滩病毒76-118株感染小鼠腹腔巨噬细胞,通过间接免疫荧光、ELISA和Realtime PCR检测病毒感染情况。结果:病毒感染3 d后,间接免疫荧光和ELISA检测到病毒核衣壳蛋白的表达,Realtime PCR检测到病毒核酸的表达。结论:建立了汉滩病毒感染小鼠腹腔巨噬细胞的模型,为进一步阐明汉滩病毒的发病机制奠定了基础。; 张尧冯伟张晓晓应旗康刘梓谕吴兴安王芳; 关键词：汉滩病毒小鼠腹腔巨噬细胞

汉滩病毒感染SCID小鼠动物模型的建立: 2016年; 目的通过检测汉滩病毒(HTNV)76-118株感染SCID小鼠组织中的特异性病毒抗原、核酸的分布以及病理学变化,以建立汉滩病毒感染动物的评价体系。方法取汉滩病毒76-118株病毒液通过肌肉注射接种SCID小鼠,接种3 d后,取小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑等组织,并分别利用ELISA法检测各组织中的病毒特异性抗原;利用q RT-PCR法检测各组织中的病毒RNA;利用HE染色法检测各组织中的病理学变化。结果SCID小鼠感染汉滩病毒后,用夹心ELISA法可在其心、肝、脾、肺、肾组织中检测到HTNV特异性抗原,平均P/N值分别为2.33、7.41、8.13、7.40、2.89,其中脾病毒抗原含量最高;以q RT-PCR法检测小鼠各脏器组织中的HTNV核酸,在实验组小鼠的心、肝、脾、肺、肾中均可检测到病毒核酸,与对照组相比,其相对量分别达到2^(2.11)、2^(6.23)、2^(8.21)、2^(5.26)、2^(3.79)倍,其中脾病毒核酸含量最多;HE染色法可见肝、脾、肺中伴有显著的病理学变化。结论成功检测了汉滩病毒感染SCID小鼠后组织中特异性抗原、核酸的分布以及病理学变化,从而为建立汉滩病毒感染动物的评价体系提供一种参考。; 马瑞雪程林峰马铁军王敬增应旗康张晓晓刘蓉蓉王芳张芳琳吴兴安; 关键词：汉滩病毒 SCID小鼠抗原病理学变化

HTNV嵌合VLP促进小鼠骨髓细胞活化的实验研究被引量：1: 2016年; 目的探讨嵌合有免疫刺激分子CD40配体(CD40L)或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的汉滩病毒(HTNV)样颗粒(VLP)对小鼠骨髓细胞活化的影响,以确定嵌合汉滩病毒样颗粒的生物学活性。方法利用真核细胞瞬时表达VLP、VLP-CD40L、VLP-GM-CSF,纯化后与小鼠骨髓细胞共培养,通过流式细胞术检测小鼠骨髓细胞活化情况。结果三种汉滩病毒VLP均能促进小鼠骨髓细胞活化(P<0.05),其中嵌合有GM-CSF因子的VLP促进小鼠骨髓细胞活化更为明显(P<0.01)。结论真核细胞表达的三种汉滩病毒VLP均有一定的生物学活性,为进一步研究汉滩病毒VLP疫苗奠定基础。; 马铁军张晓晓刘蓉蓉应旗康马瑞雪王敬增程林峰刘梓谕王芳吴兴安; 关键词：汉滩病毒 CD40L GM-CSF

qRT-PCR快速检测汉滩病毒抗体中和活性实验方法的建立: 2017年; 目的:建立一种基于qRT-PCR的微量细胞中和实验改良法,快速、定量检测汉滩病毒感染中的中和抗体活性。方法:将本室前期制备的抗汉滩病毒高中和活性鼠源性单抗3G1、鼠/人嵌合单抗1D9和感染剂量为100 TCID50的病毒混合液于37℃孵育1 h后感染Vero-E6细胞,提取细胞总RNA。根据GenBank数据库中汉滩病毒76-118株S基因序列设计特异性引物,在上述实验基础上以细胞总RNA为检测样品,建立qRT-PCR快速、定量检测汉滩病毒感染中中和抗体活性的实验方法。结果和结论:建立了一种基于qRT-PCR的微量细胞中和实验改良法,可定量测定汉滩病毒感染中的中和抗体活性,该法具有快速、灵敏、特异和重复性好等优点。; 张晓晓张尧冯伟程林峰王芳应旗康马瑞雪马铁军刘梓谕刘蓉蓉张亮叶伟张芳琳徐志凯吴兴安; 关键词：汉滩病毒 QRT-PCR 中和抗体肾综合征出血热

细胞外钾离子浓度对汉滩病毒复制的影响的研究: 应旗康

羊布鲁菌外膜蛋白omp2b的克隆,原核表达及纯化被引量：1: 2011年; 研究羊布鲁菌外膜蛋白omp2b基因的克隆,原核表达,以及纯化。根据羊布鲁菌M5株外膜蛋白omp2b蛋白基因序列设计引物,扩增出大小约为1 130 bp的目的基因片断,克隆入融合表达载体pGEX-4T-1,构建重组质粒pGEX-4T-1-omp2b。在大肠埃希菌中将该蛋白表达并用亲和层析法纯化。用Western-blot分析方法鉴定纯化蛋白。结果成功构建了pGEX-4T-1-omp2b原核表达载体并在大肠埃希菌中表达了omp2b基因,纯化后所获得的蛋白与目的蛋白大小一致且与兔抗布鲁菌血清发生特异性反应,说明其为布鲁菌omp2b蛋白。本研究成功构建了pGEX-4T-1-omp2b原核表达载体,并且在大肠埃希菌中进行表达,纯化的omp2b蛋白具有良好的免疫原性。; 张蕾张亮于澜白文涛应旗康李凯程林峰叶伟吴兴安徐志凯张芳琳; 关键词：克隆纯化

抗汉滩病毒鼠/人嵌合抗体工程细胞的驯化、抗体表达及鉴定: 2016年; 目的:通过对稳定表达抗汉滩病毒鼠/人嵌合抗体的CHO细胞进行驯化,检测其抗体的表达情况,并对所表达抗体的生物学活性进行初步鉴定。方法:将本课题组前期筛选得到的稳定高表达细胞株1-D9进行无血清驯化,使其适合悬浮培养后接种到摇瓶,通过调整不同的培养条件,每天检测细胞的活率和抗体表达量,并对表达的抗体进行生物学活性鉴定。结果:通过驯化得到了适合悬浮培养的CHO细胞株,其抗体表达量高,生产周期短;并优化了其悬浮培养条件,表达的抗体经鉴定其生物学活性稳定。结论:优化了抗汉滩病毒鼠/人嵌合抗体表达条件,为下一步工业化生产提供了实验依据。; 张晓晓冯伟张尧程林峰应旗康马瑞雪马铁军刘梓谕刘蓉蓉王芳张亮叶伟张芳琳徐志凯吴兴安; 关键词：汉滩病毒 CHO细胞嵌合抗体

汉滩病毒核蛋白CTL表位肽联合不同免疫佐剂的免疫学特性研究: 2016年; 目的:研究汉滩病毒(HTNV)核蛋白细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位肽联合不同免疫佐剂免疫C57BL/6小鼠后的免疫学特性,确立一种免疫效果良好的多肽免疫C57BL/6小鼠方案。方法:分别用氢氧化铝、弗氏佐剂和脂质体作为免疫佐剂与汉滩病毒核衣壳蛋白上的CTL表位肽段混合,经皮下注射免疫C57BL/6小鼠,共免疫3次,每次间隔2周;免疫结束后分离小鼠脾细胞,并分别采用ELISPOT和CTL杀伤试验进行检测。结果:HTNV核蛋白CTL表位肽联合弗氏佐剂加脂质体组小鼠脾细胞分泌IFN-γ能力和CTL杀伤能力优于其他各实验组(P<0.01)。结论:HTNVCTL表位肽联合弗氏佐剂加脂质体免疫C57BL/6小鼠效果最佳,可为HTNV多肽疫苗的免疫策略提供参考。; 马瑞雪程林峰马铁军王敬增应旗康张晓晓刘蓉蓉王芳刘梓谕张亮叶伟张芳琳徐志凯吴兴安; 关键词：免疫佐剂汉滩病毒表位肽 C57BL/6小鼠

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应旗康

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