高刚
- 作品数：7 被引量：6H指数：2
- 供职机构：山东省医药生物技术研究中心更多>>
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- 重组腺相关病毒载体在肝疾病基因治疗中的应用及局限性被引量：2
- 2009年
- 基因治疗(gene therapy)是近十年来随着现代分子生物学技术的发展而诞生的新的生物医学治疗技术。重组腺病毒伴随病毒是一种具有开发潜质的病毒载体,因此近年来对它的研究很是受人关注。肝炎、肝硬化、肝癌在我国乃至全世界是严重损害人们的健康,据此,国内外的研究人员对rAAV在肝疾病基因治疗方面做了大量的工作,本文对rAAV在肝疾病基因治疗中的应用和局限性研究进行综述。
- 赵丽韩金祥鲁艳芹高刚
- 关键词：基因治疗肝脏重组腺相关病毒
- 不同启动子驱动HDV核酶的逆转录病毒载体构建
- 2009年
- 目的分别构建CMV、H1、tRNA、U2、U3和U6启动子驱动反式丁型肝炎病毒核酶(HDV核酶)的逆转录病毒表达载体。在这些载体中,HDV核酶设计为靶向HBV基因序列PreS2和C区。方法用PCR技术分别扩增CMV、U2和U3启动子,并连入pMD18-T载体。合成靶向PreS2和C区HDV核酶并利用SalⅠ和H indⅢ的酶切位点分别连入逆转录病毒表达载体pLEGFP(pLEGFP-R z)。然后利用BamHⅠ和SalⅠ的酶切位点分别把CMV、H1、tRNA、U2、U3和U6启动子连入重组载体pLEGFP-R z。所有的重组载体经PCR和酶切的方法验证。结果成功地构建了分别含有6种启动子驱动HDV核酶的逆转录病毒载体。结论这些重组载体的构建为筛选高效表达核酶的启动子奠定基础。同时这些重组载体也可用于进一步研究HDV核酶抑制HBV复制的效率。
- 高刚鲁艳芹韩金祥赵丽
- 关键词：启动子乙型肝炎病毒逆转录病毒载体
- 乙型肝炎病毒基因型、拉米夫定耐药突变的RFLP检测及临床相关性分析被引量：2
- 2007年
- 目的对乙型肝炎(简称乙肝)肝病毒进行基因分型,检测患者服用拉米夫定后血清中乙肝病毒突变情况,并进行临床相关性分析。方法设计乙肝病毒突变及基因分型特异性引物和酶切位点,系用限制性片断长度多态性(RFLP)分析法检测突变类型并对乙肝病毒进行基因分型。结果在115份被检测的血清标本中,75份(65%)标本为野生型,18份(15.7%)标本为YIDD突变,10份(8.7%)标本为YVDD突变;在混合型突变中,YIDD+YVDD存在于6份(5.2%)标本中,YMDD+YIDD存在于4份(3.5%)标本中,2份(1.7%)标本为YMDD+YVDD混合突变型;未检测到YSDD突变型。在180位点的突变检测中,98份(85%)标本为野生型,5份(4.3%)标本为rtL180M,L180M+M204I存在于8份(6.96%)标本中,另4份(3.5%)标本为L180M+M204V混合突变型。在115份标本中,102份标本为C基因型,13份标本为B基因型,未发现其他基因型。通过χ2检验,乙肝病毒YMDD突变与患者的性别、血清DNA水平、病毒基因型之间没有相关性(P>0.05),而乙肝病毒YMDD变异与患者服用拉米夫定的时间长短有相关性(P<0.05),用药时间越长,发生突变的几率越大。乙肝患者服用拉米夫定后,180位点的突变和204位点突变具有相关性(P<0.05)。结论采用RFLP分析法可以有效地检测乙肝病毒YMDD突变并对乙肝病毒进行基因分型。
- 卜范峰鲁艳芹韩金祥王丽娜冯照雷沈忠林高刚
- 关键词：乙型肝炎病毒突变基因分型YMDD
- 反义技术在抗HBV感染中的应用
- 2009年
- 反义技术是近些年来随着现代分子生物学技术的发展而产生的新的生物医学治疗技术。它采用反义核酸分子抑制、封闭或破坏靶基因组的技术手段，包括反义寡核苷酸、核酶及RNA干扰等。反义分子通过与靶基因异性互补配对结合，阻断靶基因的复制、转录或翻译过程，从而发挥抗病毒作用。针对乙型肝炎病毒的反义技术也有了广泛而深入的研究。根据反义技术在分子、细胞以及动物水平上的研究表明：反义技术能够高效、特异地抑制HBV的复制与表达。
- 高刚鲁艳芹韩金祥赵丽
- 关键词：反义技术乙型肝炎病毒反义寡核苷酸核酶RNA干扰
- rAAV载体介导的HDV核酶对HBV基因表达的抑制作用
- 2009年
- 目的探讨重组腺相关病毒介导的HDV核酶在细胞内抑制乙型肝炎病毒基因表达的作用。方法将针对HBV基因序列C区的反式HDVR z与U6启动子和绿色荧光蛋白基因EGFP及其启动子CMV共同插入腺相关病毒载体pSNAV中并取代其原有CMV启动子区域,构建为pSNAV-CR z重组载体。并将pSNAV-CR z、pSNAV及pLEGFP质粒转染HepG2.2.15培养细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光,对转染后培养细胞内蛋白进行HBeAg和HBsAg的ELISA分析。结果所构建的重组载体经双酶切及PCR验证与实验设计一致。重组载体转染培养细胞后,荧光显微计数表明,pSNAV-CR z的转染效率为30%。HBeAg和HBsAg的ELISA检测显示,pSNAV-CR z重组载体对HepG2.2.15细胞中HBV病毒的HBeAg和HBsAg表达抑制率分别为63.5%和50.07%。结论细胞水平试验证明,重组腺相关病毒载体介导的反式HDVR z在体外培养细胞水平对HBV的复制起到一定的抑制作用。
- 赵丽韩金祥鲁艳芹高刚
- 关键词：乙型肝炎病毒HDV核酶重组腺相关病毒基因表达
- 双启动子对增强型绿色荧光蛋白表达的影响被引量：2
- 2009年
- 目的研究双启动子对增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达的影响及双启动子的启动效率。方法分别将H1、U2、U3和U6启动子克隆至pEGFP-N1载体中的MCS位点处,构建CMV与以上各个启动子的双启动子表达载体。将重组载体转染293T细胞,荧光显微镜观察,流式细胞术检测转染效率及EGFP基因的表达效率(以荧光指数表示)。结果双启动子重组表达载体经PCR和酶切证明构建正确。流式细胞术检测表明,pEGFP-N1载体与分别插入H1、U2、U3和U6启动子的双启动子重组表达载体的转染效率分别为26.57%±1.54%、28.57%±0.99%、16.14%±1.69%、22.63%±1.77%和17.89%±1.84%;EGFP基因的表达效率分别为142.79±31.26、103.59±25.90、19.67±0.52、58.16±14.58和15.40±1.92。结论CMV与H1启动子联合驱动EGFP的表达效果与CMV单独驱动相近,而CMV分别与U2、U3和U6启动子联合驱动EGFP的表达效果显著低于CMV单独驱动。
- 高刚鲁艳芹韩金祥赵丽
- 关键词：双启动子增强型绿色荧光蛋白流式细胞术
- 高效表达反式HDV核酶的载体的优化及其抑制HBV基因表达的研究
- 目的：构建能够高效表达反式HDV核酶(Ribozyme,Rz)的载体,并且研究含有HDV核酶的表达载体抑制HBV基因表达的效率。方法：设计并合成针对HBV基因序列中的PreS2和C区的反式HDV核酶,并且在两端插入Sal...
- 高刚鲁艳芹韩金祥
- 关键词：启动子HDV核酶HBVHEPG2.2.15细胞基因表达
