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金科华: 作品数：24 被引量：27H指数：3; 供职机构：湖北科技学院更多>>; 发文基金：博士科研启动基金国家自然科学基金广东省自然科学基金更多>>; 相关领域：生物学医药卫生更多>>

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唾液富组蛋白5表达载体的构建: 2008年; 目的将唾液富组蛋白5 cDNA克隆至表达载体pGEX-4T-1。方法EcoRⅠ+SalⅠ双酶切克隆载体pMD19-T-hrp5及pGEX-4T-1,回收目的片段hrp5及双酶切载体pGEX-4T-1,将二者连接后转化大肠杆菌DH5α,氨苄青霉素筛选阳性菌落,PCR、酶切、测序鉴定重组质粒。结果唾液富组蛋白5的cDNA正确克隆至表达载体pGEX-4T-1,无突变。结论重组载体pGEX-4T-1-hrp5构建成功。; 周琦金科华罗德生王彪程新潮王梅娟段海瑞; 关键词：克隆

BamHⅠ+XhoⅠ双酶切质粒电泳弥散原因初探: 2017年; 目的探讨TaKaRa公司(中国大连)快速限制酶Bam HⅠ+XhoⅠ37℃双酶切质粒p ET-28a、p ET-28a-SDHA产生弥散的原因。方法比较4种条件下酶切对弥散的影响:(1)Bam HⅠ+XhoⅠ37℃双酶切Elution Buffer(EB)洗脱或水洗脱的质粒;(2)NdeⅠ+XhoⅠ37℃双酶切EB洗脱或水洗脱的质粒;(3)先Bam HⅠ30℃酶切,再XhoⅠ37℃酶切;(4)Bam HⅠ分别于30℃、37℃单酶切。结果 (1)Bam HⅠ+XhoⅠ37℃双酶切EB或水洗脱的质粒均产生严重弥散;(2)NdeⅠ+XhoⅠ37℃双酶切EB洗脱或水洗脱的质粒无弥散;(3)Bam HⅠ30℃酶切+XhoⅠ37℃酶切,无弥散;(4)Bam HⅠ30℃单酶切无弥散,37℃单酶切严重弥散。结论 Bam HⅠ+XhoⅠ37℃酶切质粒电泳弥散是Bam HⅠ在此温度下的星活性所致。; 金科华张惠敏杨志珅金天颖卢晓晓; 关键词：双酶切弥散

人LDHB的原核表达及体外抑制剂筛选模型的建立被引量：1: 2018年; 目的建立人乳酸脱氢酶B(LDHB)体外抑制剂筛选模型。方法用一对5'端分别带NdeⅠ、XhoⅠ位点的引物扩增LDHB cDNA。LDHB cDNA经NdeⅠ+XhoⅠ双酶切后与同样酶切的pET-28a质粒连接,连接产物转化大肠杆菌DH5α。将筛选的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用0.2 mmol/L IPTG诱导LDHB表达,镍离子亲和层析柱纯化LDHB。以丙酮酸钠和NADH为底物,通过检测340 nm波长处光密度值的变化,确定LDHB及其抑制剂棉酚的最适浓度,并计算模型的Z因子。结果 LDHB的表达量为25 mg/L,LDHB、棉酚的最适浓度分别为22.5μg/L、10μmol/L,筛选模型的Z因子为0.91。结论建立了成本低、可靠性强、适合高通量的LDHB体外抑制剂筛选模型。; 吴珊刘洁金科华; 关键词：抑制剂体外实验

人磷酸甘油酸变位酶1在大肠杆菌中的表达及纯化: 2022年; 目的表达与纯化人磷酸甘油酸变位酶1(PGAM1),为后续研究奠定基础。方法用SnapGene设计5′侧翼添加Nde I和Xho I位点的上、下游引物,PCR扩增cDNA,扩增产物与质粒pET-28a经Nde I和Xho I酶切后进行琼脂糖凝胶电泳分离、胶回收纯化。用DNA ligase连接cDNA和pET-28a,热激法将连接产物转化大肠杆菌DH5α,转化产物涂布于含卡那霉素(Kanamycin)的LB平板(LBK板),筛选抗性菌落。于含卡那霉素的LB培养基(LBK培养基)培养抗性菌落,抽提质粒,进行酶切和测序鉴定。将重组质粒同法转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选抗性菌落。将一个抗性菌落接种于LBK培养基,37℃250r/min培养至OD约0.8。用0.1mmol/L IPTG,16℃诱导PGAM1表达20h。收集细胞,超声破碎,离心取上清,用Ni-NTA试剂盒纯化PGAM1。超滤浓缩纯化的PGAM1,并用不含咪唑的缓冲液进行交换,降低PGAM1溶液中的咪唑浓度。BCA法测定PGAM1浓度,保存PGAM。结果重组质粒pET-28a-PGAM1构建成功,基因工程菌pET-28a-PGAM1-BL21(DE3)经IPTG诱导,PGAM1获得可溶性表达,产量达120mg/L。结论高纯度、高产的PGAM1为后续研究奠定了坚实基础。; 金科华; 关键词：纯化超滤

唾液富组蛋白5基因的设计、改造及其在Pichia pastoris中表达的研究: 唾液富组蛋白5(histidine-rich proteins 5，简写HRP 5)，为一直链阳离子多肽，由24个氨基酸(AA)组成，含7个组氨酸，分子量3037Da，主要存在于人类和灵长类动物腮腺、颌下腺和舌下腺唾液分...; 金科华; 关键词：白色念珠菌基因表达 PICHIAPASTORIS; 文献传递

转氨基作用与氨基酸纸层析实验的改进被引量：1: 2020年; 目的改进转氨基作用与氨基酸纸层析方式和方法,提高实验效率。方法在新的转氨基反应容器和点样方式下,比较缓冲液类型、转氨基时间、肝匀浆浓度及保存时间、磷酸吡哆醛用量对转氨基的影响。结果适当缩短反应时间、适当稀释和保存肝匀浆对转氨基影响较小;缓冲液类型和磷酸吡哆醛不影响转氨基。结论本研究改进了转氨基反应条件和点样方式,提高了实验效率,改善了实验结果。; 游云悠魏友煜左越黎威巍罗丽丹金科华; 关键词：肝匀浆

敲低和过表达LDHB对HeLa细胞生长的影响被引量：3: 2016年; 目的研究敲低和过表达LDHB(lactate dehydrogenase B)对HeLa细胞生长的影响。方法根据慢病毒质粒pLn(pLL3.7-neo)特点,设计三对分别靶向LDHB c DNA 48,201,443位核苷酸序列的shRNA(short hairpin RNA)引物,退火后与pLn重组。同时,将LDHB cDNA与慢病毒质粒pIp(pBOBI-IRES-puro)重组,获得的重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,将获得的病毒上清感染HeLa细胞,Western blot鉴定LDHB的敲低和过表达对LDHB蛋白水平的影响,并观察其对HeLa细胞生长的影响。结果靶向LDHB第48位核苷酸的shRNA显著敲低LDHB(P<0.01),443位次之,201位无敲低作用。shRNA序列对HeLa细胞生长的抑制作用与其敲低效果成正相关。转染pIp-LDHB显著升高LDHB在HeLa细胞中的表达水平(P<0.01),但不影响其生长。结论敲低LDHB抑制HeLa细胞生长,下调LDHB的表达可能有助于宫颈癌的治疗。; 金科华刘复兴; 关键词：过表达 HELA细胞

人LDHA原核表达、纯化及体外抑制剂筛选模型的建立被引量：5: 2015年; 在多数肿瘤细胞中高度表达的乳酸脱氢酶A(LDHA)与肿瘤的发生、发展和预后密切相关,筛选LDHA小分子抑制剂可提供一种富有潜力的靶向抗肿瘤策略.本研究以pET-28a为载体,构建了人LDHA表达质粒并于大肠杆菌BL21(DE3)中稳定表达,产量达到2.65mg/L.基于LDHA的催化反应建立了以丙酮酸钠和还原型烟酰胺腺嘌呤二核甘酸(NADH)为底物的筛选模型.实验结果表明:模型的LDHA最适质量浓度为60ng/mL,以质量分数0.25%草酸铵为阳性对照,筛选模型的Z因子为0.812.至此,本研究建立了LDHA抑制剂体外生化筛选模型,其成本低、可操作性强,符合高通量筛选要求,为发现新颖的LDHA抑制剂奠定了基础.; 金科华吴昕瑞王苗苗宋思扬; 关键词：抑制剂

人G6PD在大肠埃希菌中的表达及体外抑制剂筛选模型的建立: 2022年; 目的表达人6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)并建立其体外抑制剂筛选模型。方法设计一对5′端分别带NdeⅠ、XhoⅠ位点的引物,PCR扩增G6PD cDNA。将cDNA和质粒pET-28a经NdeⅠ+XhoⅠ酶切后连接,连接产物转化大肠杆菌Top10。将鉴定的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用0.4 mmol/L IPTG诱导G6PD表达,镍离子亲和层析柱纯化G6PD。以6-磷酸葡萄糖(G6P)和烟酰胺腺嘌呤核苷二磷酸(NADP+)为G6PD的底物和辅因子,检测340 nm波长处光吸收值(A_(340))的变化,确定G6PD及其抑制剂脱氢表雄酮(DHEA)的最佳浓度,计算模型的可靠性指数—Z′因子。结果构建了重组质粒pET-28a-G6PD,重组菌BL21(DE3)-pET-28a-G6PD经IPTG诱导后,可溶性G6PD表达量为2.5 mg/L,G6PD、DHEA的最适浓度分别为900μg/L、20μmol/L,筛选模型的Z′因子为0.88。结论在大肠杆菌中表达了有活性的G6PD,建立了可靠的体外抑制剂筛选模型。; 金科华游云悠魏友煜左越柯志强尧青刘洁; 关键词：抑制剂

唾液HRP5第17位密码子反义突变对其在毕赤酵母中表达的影响: 唾液富组蛋白5(HRP5)是近年来发现的一种富含组氨酸的广谱抗菌肽,由24个氨基酸组成,主要存在于人类和灵长类动物唾液分泌物中,研究表明 HRP5具有多种活跃的生物功能,能有效杀灭耐药的白色念珠菌,毒副作用小:但唾液中 ...; 金科华; 文献传递

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