郭毅
- 作品数：6 被引量：8H指数：2
- 供职机构：上海交通大学医学院实验动物科学部更多>>
- 发文基金：上海市科技兴农重点攻关项目上海市基础研究重大（重点）项目上海市教育委员会重点学科基金更多>>
- 相关领域：生物学更多>>
- 利用PCR产物快速构建免HPRT基因无启动子打靶载体
- 2009年
- 目的探讨构建兔HPRT基因打靶载体的方法，为下一步获得兔HPRT基因敲除动物模型和转基因兔奠定基础。方法首先在已经筛选到含有兔全长次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（Hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase，HPRT）基因BAC克隆（LBNL1-304M19）的基础上，利用Red重组系统，从此克隆上将一段12．5kb无启动子的HPRT基因组片段克隆到pKS-质粒上，产生pKS—rHPRT质粒。然后基于pKS-rHPRT和pIGCN21质粒，通过PCR的方法获得两个不同的带有50bp HPRT基因同源序列的IRES-eGFPCre—Frt／Neo／Frt同源重组片段，最终构建HPRT基因敲除打靶载体和无启动子基因敲入型打靶载体。结果PCR、限制性内切酶及DNA序列测定，表明载体构建成功。结论成功快速地构建了HPRT基因敲除打靶载体和无启动子基因敲入型打靶载体。同时对利用同源重组技术敲除或插入DNA片段的效率进行了研究。
- 郭毅张传山谷瑞环姚刚陈学进
- 关键词：RED重组PCR技术打靶载体
- 利用Red同源重组系统构建兔次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因打靶载体被引量：1
- 2008年
- 利用EL350基因工程菌进行同源重组,成功进行基因敲除已有报道,但利用该系统进行兔次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase,HPRT)基因突变和基因打靶方面的研究还没有报道。实验首先在已经筛选到含有兔全长HPRT基因BAC克隆(LBNL1-304M19)的基础上,利用Red重组系统,通过Gap-Repair方式从此克隆上将一段47kb无启动子的HPRT基因组片段(不含有第1个外显子)克隆到pBACLinkSp质粒上,产生pBACLinkSp-rHPRT质粒。然后基于pBACLinkSp-rHPRT质粒,设计不同的同源臂,从而删除了HPRT基因的不同编码区,成功构建了三个不同的HPRT基因打靶载体。同时对利用同源重组技术敲除不同大小的DNA片段的效率进行了研究。基于实验所构建的三个不同的兔HPRT基因打靶载体,为探索兔成纤维细胞和胚胎干细胞基因打靶的适宜条件,及进一步获得兔HPRT基因敲除动物疾病模型奠定了基础。
- 张传山李峰姚刚郭毅鲍柳君陈学进
- 关键词：RED重组基因敲除
- 应用RNA干扰技术体外抑制兔成纤维细胞HGPRT的表达及其核移植研究(英文)被引量：3
- 2009年
- 次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(hypoxanthine guaninephos phoribosyltransferase,HGPRT)的功能缺失与痛风、肾结石和雷纳综合症(Lesch-Nyhan Syndrome)等疾病相关.制作HGPRT基因表达降低的模式动物,将有利于人们对这种疾病的发病机理和治疗做进一步的研究.构建了针对HGPRT基因表达的shRNA干扰载体,并将质粒转染兔成纤维细胞,获得携带该干扰片段的转基因细胞系,经PCR鉴定转基因成纤维细胞克隆阳性率为83.3%.RT-PCR及Western blot检测结果表明转基因干扰成纤维细胞系HGPRT mRNA和蛋白质表达量明显降低.最后,以转基因成纤维细胞进行核移植,囊胚率为27.8%,与正常来源的成纤维细胞囊胚率相比较差异不显著.说明,通过RNAi可稳定干扰兔成纤维细胞HGPRT基因的表达,为进一步通过核移植技术建立HGPRT RNAi转基因兔模型创造条件.
- 郭毅张传山李善刚李锋谷瑞环邢凤英李垚姚刚陈学进
- 关键词：RNA干扰核移植
- 成体兔次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因的打靶研究
- 2010年
- 目的构建兔HPRT基因打靶载体。方法在已经筛选到含有兔全长次黄嘌呤一鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（Hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase，HGPR乃基因BAC克隆（LBNL1—304M19）的基础上，利用Red重组系统，从此克隆上将一段12．5kb无启动子的HGPRT基因组片段克隆到pKS-质粒上，产生pKS-HGPRT质粒。然后基于pKS-HGPRT和pEGFP—C1-SD1211质粒，构建了含有绿色荧光蛋白（GFP）及新霉素（neo）筛选标记基因的打靶载体pKS-HGPRT-GFP—neo。结果将线性化的打靶载体通过脂质体转染的方法整合到成体兔成纤维细胞基因组中，利用G418及6-TG进行细胞克隆的抗药物筛选，共得到抗性细胞克隆20个。对细胞克隆进行PCR及测序初步鉴定，获得8个发生同源重组的细胞克隆，还需利用Southern blotting做进一步验证。结论成功快速地构建了且PR丁基因敲除型打靶载体，为下一步进行体细胞核移植制备HGPRT基因敲除转基因克隆兔奠定基础。
- 王伟张传山郭毅谷瑞环丁雷姚刚陈学进
- 关键词：基因敲除细胞筛选
- 成体兔转基因成纤维细胞的克隆分离及其核移植研究被引量：3
- 2009年
- 哺乳动物体细胞核移植及其与转基因技术的结合为转基因动物的研究提供了新的思路和方法.然而,单个转基因细胞克隆的分离培养一直比较困难,很大程度上限制了转基因动物的研制.将pRNAT-U6.1/Neo质粒转染成体兔成纤维细胞,通过24孔细胞培养板分离培养法获得来源于单个转基因成纤维细胞克隆.由于单个成纤维细胞克隆在新鲜DMEM培养液中生长比较困难或缓慢,采用由DMEM/F12制备的条件性培养液进行筛选.以转基因成纤维细胞为供体细胞进行核移植,囊胚率为23.5%,与来源于成体兔正常成纤维细胞相比较差异不显著.并且利用PCR或多重PCR方法鉴定筛选的转基因细胞克隆及其核移植胚胎中整合的NeoR基因和常染色体β-actinDNA.为转基因哺乳动物细胞的分离培养和核移植胚胎的鉴定提供可靠的方法,缩短了转基因动物的研制周期,降低生产成本,同时为进一步通过核移植技术获得转基因克隆兔提供了条件.
- 张传山郭毅谷瑞环李善刚李峰王伟丁雷邢凤英姚刚陈学进
- 关键词：细胞分离多重PCR核移植转基因检测
- 转基因动物技术研究进展被引量：2
- 2009年
- 转基因动物技术起始于上个世纪七十年代末，随着生物科学的飞速发展，此技术也得到很大的进步。转基因动物技术在生物医药、农业等领域具有重要的作用。本文就转基因动物技术的发展、方法、应用及面临的问题做一综述。
- 谷瑞环陈学进郭毅
- 关键词：转基因动物显微注射核移植
