邱峰龙
- 作品数：11 被引量：19H指数：3
- 供职机构：扬州大学动物科学与技术学院更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划转基因生物新品种培育专项国家科技重大专项更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 精原干细胞介导法制备转基因羊的研究进展被引量：1
- 2012年
- 精原干细胞介导法制备转基因动物是用试验导入的方法将外源基因移入动物细胞并整合到其基因组中,伴随着精原干细胞分化成精子,通过受精最终使外源基因得以表达。近年来,随着对精原干细胞研究的不断深入,人们发现其在建立转基因动物方面具有巨大的应用潜力和优势。作者从精原干细胞的生物学特性及携带外源基因的原理等方面阐述了其应用于转基因动物制备的理论机制,同时介绍了精原干细胞介导法在制备转基因动物方面,特别是转基因羊生产中的应用现状。
- 邱峰龙李碧春
- 关键词：外源基因转基因羊
- 山羊骨骼肌卫星细胞系分离、培养及其成肌诱导分化研究被引量：3
- 2013年
- 采用外科手术方法从山羊四肢肌肉或背最长肌获取3mm×3mm肌肉束,置于1mg.mL-1 IV胶原酶中,室温消化30min,分散肌丝,在体视显微镜下分离肌丝;再用0.25%胰酶-EDTA于37℃下消化10min,以释放出骨骼肌卫星细胞(SSC)和其他细胞。连续5代在增殖培养体系(80%DMEM/F12+10%胎牛血清+10%马血清)中采用差速贴壁方法,收集接种后20min的贴壁细胞,对纯化的SSC采用免疫荧光方法检测SSC特异标志蛋白Pax-7,结果表明:(92.5±3.4)%细胞表达Pax-7,(93.0±1.8)%细胞表达MyoD,说明90%以上细胞为SSC。将纯化的SSC细胞分别在诱导培养体系Ⅰ(93%DMEM/F12+1%胎牛血清+1%马血清+1%non-AA)和II(99%Opti-MEM+1%non-AA)中进行诱导培养,通过细胞形态学观察和成肌细胞早期标志蛋白Desmin、MyHC免疫荧光检测诱导效果,结果表明:采用体系Ⅱ能在各种细胞密度(大于1×105个.cm-2)下诱导山羊SSC向成肌方向分化,而采用体系Ⅰ(低血清培养基)且仅当能诱导高密度山羊SSC向成肌方向分化。采用改进的SSC分离方法能够获得较高纯度的卫星细胞,比较诱导体系Ⅰ、Ⅱ认为,诱导培养体系Ⅱ适合于山羊SSC成肌诱导分化,为进一步研究SSC成肌分化机制提供素材。
- 李伟郑蒙蒙邱峰龙朱才业韦光辉王丹李碧春
- 关键词：山羊骨骼肌卫星细胞细胞培养
- 山羊iPS细胞诱导及培养体系的优化
- 2014年
- 为了高效、持续的诱导获得并培养山羊诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cells,iPS),本研究从饲养层和培养液方面进行优化。将分离获得3代以内的小鼠胎儿成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblast,MEF)、山羊胎儿成纤维细胞(Goat embryonic fibroblast,GEF)用丝裂霉素C处理后,分别按1×105 mL-1 MEF、1×105mL-1 GEF、5×104 mL-1 MEF+5×104 mL-1 GEF的密度接种,以高糖DMEM+20%胎牛血清(FBS)和KnockoutDMEM+20%血清替代物(KSR)为培养液,研究不同饲养层种类和培养液对山羊iPS细胞获得和培养的影响。结果显示,山羊iPS细胞在接种密度为5×104 mL-1 MEF+5×104 mL-1 GEF的饲养层上,使用KnockoutDMEM+20%KSR组合的培养液,山羊iPS细胞的诱导效率以及消化传代后的克隆形成率均极显著高于其他5组(P<0.01)。对该组培养的山羊iPS细胞进行碱性磷酸酶(AKP)染色呈阳性;Oct4、SSEA-1、Tra-1-60、Tra-1-81免疫荧光检测呈阳性;RT-PCR检测有Oct4、Sox2、Klf4和Nanog基因的表达;体外能分化形成类胚体。结果表明,将细胞接种在密度为5×104 mL-1 MEF+5×104 mL-1 GEF的饲养层上,使用KnockoutDMEM+20%KSR的培养液更适合山羊iPS细胞的获得和培养。本试验为山羊iPS细胞的体外研究、临床试验、动物基因组修饰和山羊胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ES)的建系奠定基础。
- 邱峰龙左其生李东李伟陈庭锋韦光辉李碧春
- 关键词：饲养层培养液IPS细胞山羊
- 猪精原干细胞体外分离培养及诱导分化的研究被引量：4
- 2014年
- 本研究旨在建立猪精原干细胞(Porcine spermatogonial stem cells,pSSCs)体外分离和诱导分化,并探索pSSCs定向分化及分化过程中关键基因的表达情况。采用差速贴壁法分离pSSCs和支持细胞(Sertoli),采用生化和免疫学方法鉴定其干细胞特性;传至3代后通过添加不同诱导剂,诱导SSCs向脂肪细胞、神经元样细胞和成骨细胞分化,并通过生化染色、qRT-PCR和免疫细胞化学检测诱导效果。结果表明:分离得到的pSSCs在饲养层上生长良好,碱性磷酸酶(AKP)及SOX2、integrinα6、SSEA1、Dazl抗体鉴定均呈阳性,表明SSCs处在未分化状态。诱导8d后,甲苯胺蓝染色及NSE抗体鉴定成阳性,成功诱导SSCs为神经元样细胞;诱导16d后,ALP、Von Kossa染色及Collagon l抗体鉴定均呈阳性,诱导SSCs为成骨细胞;诱导22d后,油红O染色可见脂滴被染成红色,诱导SSCs成为脂肪细胞。在SSCs诱导过程中,qRT-PCR结果显示,Nestin和β-tubulin在6d左右表达量最高,Cbfα1和Osterix在12d左右表达量最高,PPARγ和C/EBPα在18d左右表达量最高。本研究成功分离获得pSSCs,并且pSSCs可分别定向诱导分化为成骨细胞、神经元样细胞和脂肪细胞,表达细胞特有标记基因。
- 陈庭锋王霄燕李东施青青张蕾邱峰龙刘志永庄勋卞桂华宋成义李碧春
- 关键词：精原干细胞体外培养诱导分化基因表达
- 徐淮山羊多能性转录因子mRNA制备及在成纤维细胞中的表达
- 2014年
- 【目的】克隆徐淮山羊多能性转录因子0ct4、Sox2、K1f4和c—Myc的CDS片段,构建pMD19-T—oct4、pMD19-T—sox2、pMD19-T—k1f4和pMD19-T—c—myc重组质粒,随后构建含T7启动子的pcDNA3-oct4、pcDNA3-sox2、pcDNA3-k1f4和pcDNA3-c—myc重组质粒,通过体外转录,获得该4种多能性转录因子的mRNA,并使其在徐淮山羊成纤维细胞中稳定表达。【方法】应用RT—PCR方法分别从徐淮山羊睾丸组织、皮肤组织、小肠组织中扩增多能性转录因子Oct4、Sox2、K1f4和c—Myc基因编码全序列,将该4种基因分别克隆到pMD19-T载体,构建pMD19-T—oct4、pMD19-T—sox2、pMD19-T-k1f4和pMD19-T—c—myc重组质粒。然后将pcDNA3.0载体和pMD19-T重组载体双酶切后用T4连接酶连接,构建含有T7启动子的真核表达载体pcDNA3-oct4、pcDNA3-sox2、pcDNA3-k1f4和pcDNA3-c—myc重组质粒。各重组质粒分别用限制性内切酶XhoI、XbaI单酶切,酶切后质粒模版按照体外转录试剂盒说明体外转录获得各多能性转录因子的mRNA,并对获得的mRNA进行检测,确定其稳定性和浓度。按照脂质体(体积):mRNA(质量)为1:1的比例用脂质体2000转染。转染24 h后,利用Western blot技术、间接免疫荧光实验检测徐淮山羊多能性转录因子Oct4、Sox2、K1f4和c—Myc基因的mRNA在成纤维细胞中的表达。【结果】①克隆得到的徐淮山羊0ct4、Sox2、K1f4和c—Myc基因编码序列全长分别为1 083、962、1 434和1 320 bp,并经TA克隆测序验证,其CDS序列与绵羊、人、牛和猪等的序列相似性在89%以上;②体外转录获得的4种多能性转录因子的mRNA经脂质体转染徐淮山羊成纤维细胞,在成纤维细胞中均定位于细胞核;③4种多能性转录因子的mRNA在徐淮山羊成纤维细胞中表达的蛋白与预期大小一致,分别为38、34、50和48 kd。【结论】成功克隆了徐淮山羊Oct4、Sox2、K1f4和c—Myc基因,该4种多能性转录因子的mRNA能够在徐淮山羊成纤维细胞中稳定
- 邱峰龙张亚妮倪蓉李伟陈庭锋韦光辉李碧春
- 关键词：徐淮山羊体外转录MRNA
- 过表达MyoD1基因山羊胎儿成纤维细胞系的建立及其成肌诱导分化被引量：7
- 2013年
- 【目的】通过建立过表达MyoD1基因山羊胎儿成纤维细胞系研究MyoD1基因的异位表达研究其在成肌分化中的生物作用。【方法】采用RT-PCR从激活的骨骼肌卫星细胞中克隆MyoD1基因,并将其cDNA终止密码子TGA定向突变为GGA,定向克隆至带有增强型水母绿色荧光蛋白(ehanced green fluorescent protein,eGFP)报告基因的真核表达载体pEGFP-N1中,构建融合蛋白表达载体pEGFP-MyoD1,经过酶切、测序鉴定后,采用LipofectiminTMLTX转染山羊胎儿成纤维细胞(goat embryonic fibroblast,GEF)以建立MyoD1异位表达细胞株并采用成肌诱导分化培养液进行成肌诱导分化,探究MyoD1在成肌过程中的生物学功能。【结果】成功克隆山羊MyoD1基因,并在MyoD1的开放阅读框(ORF)两端引入XhoⅠ/EcoRⅠ酶切位点,将其终止密码子TGA定点突变为GGA,定向克隆至pEGFP-N1真核表达载体,获得融合蛋白表达载体pEGFP-MyoD1;经G418(400μg.mL-1)筛选2周后,获得MyoD1异位表达的GEF细胞株;间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay,IFA)检测结果显示该细胞株能够表达Myf-5等成肌相关免疫学标志;采用成肌分化培养基分化培养处理2—3 d可见少量肌管产生,并表达MyoG、Desmin和MyHC等早期成肌分化标志,处理5 d可见大量肌管形成。【结论】成功克隆出山羊MyoD1基因,构建了pEGFP-MyoD1真核表达载体并建立过表达MyoD1 GEF细胞系,过表达MyoD1 GEF系能够在成肌诱导培养液诱导形成肌管。
- 李伟郑蒙蒙张亚妮朱才业邱峰龙韦光辉李碧春
- 关键词：基因克隆异位表达成肌分化
- 徐淮山羊Oct4启动子功能的初步分析被引量：1
- 2014年
- 为确定徐淮山羊Oct4(Octamer-binding transcription factor 4)基因启动子活性区域,并初步探讨TSA(Trichostatin A)和VPA(Valproic acid)对Oct4基因启动子活性的调控作用,文章采用Primer5.0设计包含Oct4基因启动子不同长度片段的特异性PCR引物,扩增并定向克隆至PGL3-Bacic荧光素酶报告载体,分别转染gEF、P19和COS7细胞,通过TSA和VPA诱导,进行双荧光报告基因活性检测。同时用Oct4启动子–1516^+30 bp片段替换pEGFP-N1中的CMV启动子,通过GFP荧光表达检测Oct4启动子的活性。结果表明:在gEF、P19和COS7细胞中Oct4启动子各片段均表现出不同程度的活性,且最强活性区域为上游–1516^+30 bp,基本活性区域为–238^+30 bp;在–1516~–946 bp、–615~–96 bp区域存在正调控元件,在–1936~–1516 bp、–946~–615 bp区域存在负调控元件;终浓度为1μmol/L的TSA和4 mmol/L的VPA为诱导的最佳浓度,均能显著增强Oct4基因启动子的活性;–1516^+30 bp片段能够启动GFP的表达。研究结果为揭示Oct4基因的转录调控机制奠定了基础。
- 韦光辉李东左其生张亚妮朱睿张蕾刘志永邱峰龙李碧春
- 关键词：OCT4启动子活性TSAVPA
- 徐淮山羊 Sox2 基因启动子的克隆及其活性的初步分析
- 2014年
- 本研究旨在确定徐淮山羊Sox2基因启动子区域,找出该基因启动子的核心调控区,初步探讨Sox2基因的表达调控机制。根据GenBank已公布的绵羊Sox2基因的启动子序列,设计特异性PCR引物扩增Sox2基因的一系列启动子缺失片段,经酶切、测序及生物信息学分析,构建包含Sox2基因5′侧翼区一系列启动子缺失片段的pGL3-Sox2双荧光素酶表达载体,转染COS-7和GC1细胞,并进行5-aza-2′-deoxycytidine诱导,检测不同片段的启动子活性。结果表明:徐淮山羊Sox2基因5′侧翼区-1249—+49 bp区域的启动子活性最强(COS-7细胞),-1792—+49 bp区域活性最强(GC1细胞),-224—+49 bp区域为Sox2基因启动子基本活性区域。进一步研究发现,-484―-109 bp区域存在正调控元件,-755—-484 bp区域存在负调控元件。本实验通过构建包含Sox2基因启动子不同片段的重组报告基因载体并比较其转录活性,确定了Sox2基因启动子的核心区域。另外,5-aza-2′-deoxycytidine可以显著增强Sox2启动子的活性。为进一步研究Sox2基因的表达调控机制奠定了基础。
- 韦光辉朱睿刘志永邱峰龙张振韬陈庭锋张亚妮李碧春曹文广
- 关键词：启动子活性分析山羊
- 睾丸注射法制备携带徐淮山羊过氧化氢酶体激活增殖受体γ基因转基因羊的研究被引量：1
- 2013年
- 为探究睾丸注射法制备转基因动物的可能性,将携带有徐淮山羊过氧化氢酶体激活增殖受体γ(PPARγ)和绿色荧光蛋白标签的重组载体经脂质体包裹后,将线性化的重组质粒pEGFP-PPARγ通过随机打点注射入性成熟的湖羊睾丸内,采用常规PCR、基因组DNA点杂交及蛋白免疫印迹技术检测外源PPARγ基因在湖羊体内稳定整合的能力,并检测F1代阳性个体屠宰性能、肌内脂肪含量、器官重量及肉品质。F1代羔羊检测转基因羊阳性率为13.7%,证实外源基因在转基因后代体内成功表达。阳性个体胴体重和屠宰率极显著低于对照组个体(P<0.01),阳性个体骨肉比极显著高于对照组个体(P<0.01);阳性个体背最长肌脂肪含量显著高于对照组个体(P<0.05),腰肌内脂肪含量与股二头肌内脂肪含量差异不显著(P>0.05);阳性个体肺脏和小肠极显著大于对照组个体(P<0.01),阳性个体脾脏显著大于对照组个体(P<0.05),阳性个体心脏和肺脏显著小于对照组个体(P<0.05),肝脏、肾脏、胃、睾丸、皮、头之间差异不显著(P>0.05);阳性个体股二头肌嫩度显著低于对照组个体(P<0.05),pH、肉色、失水率之间差异不显著(P>0.05)。
- 朱才业李伟朱睿韦光辉邱峰龙秦玉蓉张亚妮李碧春
- 关键词：转基因羊
- 多能性转录因子mRNA转染山羊胎儿成纤维细胞条件优化
- 2015年
- 【目的】为了优化外源多能性转录因子oct4、sox2、klf4、c-myc的mRNA转入山羊胎儿成纤维细胞(goat embryonic fibroblast,GEF)的条件,本试验针对转染试剂脂质体2000和转染方法进行研究。【方法】采用胰酶消化法,从山羊胎儿腿部肌肉组织中分离并获得了纯化的GEF细胞。根据m MESSAGE m MACHINE®T7 Ultra Kit试剂盒说明书,体外转录步骤主要有:1前期的质粒准备:首先用质粒小提试剂盒对摇菌获得的各体外转录载体质粒进行提取,随后对各体外转录载体目的基因下游进行单酶切,获得线性化质粒,最后用DNA纯化试剂盒对线性化的质粒进行纯化;2mRNA的"加帽":以线性化DNA为模板,合成带有5′端帽子结构的mRNA,添加TURBO DNase以除去模板DNA;3mRNA的"加尾":以ATP为原料,利用试剂盒自带的Poly(A)聚合酶,对已经"加帽"的mRNA进行"加尾",以合成结构完整的mRNA;4完整mRNA的纯化:按照MEGAclearTM Kit试剂盒对mRNA进行纯化。随后,将体外转录获得各转录因子的mRNA进行浓度和OD值测定。分别比较总mRNA(EGFP和4种多能性转录因子的mRNA的质量分别为0.2μg)和脂质体2000的比例为1?0.5、1?1.0、1?1.5、1?2.0以及在最佳总mRNA与脂质体2000比例体系下第2、4、6代GEF细胞的mRNA转染效率。对最佳转染体系下转染多能性转录因子mRNA的GEF细胞进行免疫荧光检测,并对转染多能性转录因子mRNA后GEF细胞的形态和数目进行观察。【结果】mRNA和脂质体2000的比例为1?1.0以及在最佳总mRNA与脂质体2000比例体系下第2代GEF细胞的mRNA转染效率均显著高于其他组(P<0.05),且本组细胞在形态和生长方面相对较好;免疫荧光检测表明,4种多能性转录因子的mRNA在GEF细胞中定位于细胞核,并获得稳定表达,在细胞质中不见多能性转录因子oct4、sox2、klf4、c-myc的表达;GEF细胞在转染4种mRNA 24h后,细胞形态由梭状慢慢向圆形靠拢;细胞活力低于对照组(山羊成纤维细�
- 肖天荣张蕾邱峰龙李伟左其生李东李碧春
- 关键词：MRNA转染转录因子
