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免疫单扩散法测定重组铜绿假单胞菌外毒素A蛋白含量方法的建立及其应用: 2015年; 目的:探索建立免疫单扩散法测定不同料液中重组铜绿假单胞菌外毒素A(recombinant Pseudomonas aeruginosa exotoxin A,r EPA)蛋白含量新方法。方法:对缓冲液系统、最佳抗体浓度和最佳观测时间等关键因素进行摸索,确定方法的最佳条件。在此基础上,对该方法的专属性、精密度、准确性和标准曲线的可靠性进行验证,并将该方法应用于r EPA柱层析纯化中不同样品目标蛋白含量的测定及回收率计算。结果:最佳缓冲系统为0.85%Na Cl溶液,最佳抗体用量为50μL·m L-1,最佳观测计算时间为4 h。方法具有较好的专属性、精密度、准确性和线性。结论:初步建立了免疫单扩散试验测定不同料液中r EPA蛋白含量新方法,为其纯化工艺的优化奠定了基础。; 李燕婷范锋锋冯宜扬金鑫吴朝今赵志强谢贵林谭小梅; 关键词：蛋白质纯化收率

不同剂量伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗在小鼠体内诱导的抗体水平分析: 2015年; 目的研究伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗免疫效果及不同剂量伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗在小鼠体内诱导的抗体水平,以确定合适的免疫剂量。方法将150只清洁级NIH雌性小鼠随机分为5组,分别为A组(0.625μg结合疫苗组)、B组(1.250μg结合疫苗组)、C组(2.500μg结合疫苗组)、D组(2.500μg多糖组)及阴性组(10mmol/L PBS),每组30只;另领取10只为空白对照(不接种)。A、B、C、D组及阴性组小鼠经腹股沟皮下注射,剂量0.1 m L/只,每隔2周免疫1次,共免疫3次,每次免疫后第7天采血。采用ELISA检测小鼠血清抗体效价,同时对不同剂量伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗在小鼠体内诱导的抗体效价进行分析比较。结果与D组相比,A、B、C三组诱导的抗体水平与之均有统计学意义(P<0.05);A组与B组、A组与C组之间的抗体水平也具有统计学意义(P<0.05),而B组与C组之间的抗体水平无统计学意义(P>0.05)。说明与多糖疫苗相比,伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗能够诱导更高的抗体水平,且具有明显的剂次加强效应。同时证明1.250μg的伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗可诱导与2.500μg伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗相同的抗体水平。结论伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗的两种免疫剂量在小鼠体内可诱导相同的抗体水平,在选择接种剂量时,可致免疫应答的无统计学意义的低剂量可能是较为经济和安全的选择。; 刘月萍罗树权冯宜扬冯琪蓉金鑫周晖国周海飞谢贵林谭小梅; 关键词：伤寒沙门菌结合疫苗多糖免疫免疫剂量

PCR结合酶切-序列比对法鉴定B群脑膜炎奈瑟菌菌株被引量：2: 2017年; 目的用PCR结合酶切-序列比对法对B群脑膜炎奈瑟菌菌株进行鉴定。方法用玻片凝集法对不同来源的15株B群脑膜炎奈瑟菌菌株进行初步检定,再用PCR结合酶切-序列比对法对上述15株菌株进行进一步鉴定,即用PCR结合酶切法扩增菌株的唾液酸转移酶sia D基因并对PCR产物进行酶切后,用BLAST软件将PCR产物测序结果与Gene Bank中原始sia D序列比对。结果 15株菌株玻片凝集结果均为阳性;15株菌株的PCR产物片段大小均为460 bp;TaqⅠ酶切后,13株菌株的酶切产物片段大小仍为460 bp,其PCR产物测序比对结果与B群脑膜炎奈瑟菌原始sia D序列同源性均达到99%;其余2株酶切产物片段大小约200 bp,与C群脑膜炎奈瑟菌sia D原始基因序列同源性分别为98%和99%。结论 15株菌株经PCR结合酶切-序列比对法鉴定,13株为B群脑膜炎奈瑟菌菌株,2株为C群脑膜炎奈瑟菌菌株;该方法可准确鉴定B群脑膜炎奈瑟菌菌株。; 杨英英罗树权于旭博乔瑞洁冯宜扬刘方蕾吴兵谭小梅赵志强谢贵林; 关键词：菌种鉴定聚合酶链反应

动态浊度法检测细菌内毒素含量在重组铜绿假单胞菌外毒素A制备中的应用被引量：2: 2016年; 目的:应用动态浊度法监测重组铜绿假单胞菌外毒素A(r EPA)制备各阶段料液中的细菌内毒素含量,为其工艺优化和质量控制提供依据。方法:参考应用《中华人民共和国药典》2015年版三部载录的动态浊度法测定细菌内毒素含量,对该方法的专属性、精密度、重现性、准确性和标准曲线的可靠性进行了验证,并将该方法应用于r EPA制备各阶段料液中细菌内毒素含量的测定及细菌内毒素去除效果的评价。结果:该方法具有较好的专属性、精密度、重现性、准确性。结论:经方法验证显示该方法的专属性、精密度、重现性、准确性等技术参数达到了相关验证要求,结果稳定可靠。现有r EPA制备工艺能稳定、有效地去除细菌内毒素,纯化后r EPA中细菌内毒素含量较低。本研究为r EPA制备过程中细菌内毒素去除效果的评价提供了准确的参考数据。; 李燕婷范锋锋毛睿金鑫冯宜扬许博谢贵林谭小梅; 关键词：动态浊度法细菌内毒素

重组铜绿假单胞菌外毒素A含量SDS-PAGE检测方法的建立及验证: 2016年; 目的建立测定重组铜绿假单胞菌外毒素A（recombinant exotoxin of Pseudomonas aeruginosa,r EPA）含量的SDSPAGE法,并进行验证。方法采用SDS-PAGE,经考马斯亮蓝R-250染色后,利用Image Lab软件分析获得目标蛋白条带光密度值,计算目标蛋白在待测样品中的含量。对建立的方法进行专属性、准确性和重复性验证,确定检测范围,并用建立的方法检测r EPA宿主湿菌体中r EPA发酵产量及r EPA宿主菌休克液柱层析纯化样品中r EPA含量。结果 r EPA含量在100~600μg/ml范围内与其对应条带的光密度值具有良好的相关性,决定系数在0.97以上。大肠埃希菌固有组分及纯化过程中常用的添加物对r EPA含量检测均未产生明显影响,专属性较好;用建立的方法检测500、300、150μg/ml r EPA样品10次的回收率分别为（102.32±4.18）%、（102.77±4.94）%和（95.04±16.41）%,CV值分别为4.08%、4.81%和17.27%。各批r EPA发酵产量为250~500 mg/L,三步柱层析纯化后,r EPA总回收率约为50%。结论建立了测定r EPA含量的SDS-PAGE法,该方法专属性、准确性和重复性良好,为r EPA生产工艺的优化奠定了基础。; 范锋锋李燕婷金鑫冯宜扬夏莲坤刘月萍朱衍志赵志强谢贵林谭小梅; 关键词：SDS-PAGE 收率

白喉毒素无毒突变体H21G蛋白的分泌性表达及纯化: 2016年; 目的原核分泌性表达白喉毒素无毒突变体H21G蛋白并进行纯化,为下一步开发以重组H21G蛋白为基础的疫苗奠定基础。方法以p ET16a-H21G质粒为模板,PCR扩增H21G基因,亚克隆至p ET22b载体中,构建重组原核表达质粒p ET22b-H21G,转化感受态大肠埃希菌BL21（DE3）,IPTG诱导重组H21G蛋白分泌性表达。重组蛋白经渗透压休克,DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和Phenyl Sepharose 6FF（high sub）疏水层析纯化后,使用还原/非还原SDS-PAGE和HPLC法分析纯化蛋白的纯度,窄范围等电聚焦分析其等电点,MALDI-TOF质谱法分析其相对分子质量,N-末端测序法鉴定N-末端氨基酸序列。结果重组原核分泌性表达质粒p ET22b-H21G经双酶切（NcoⅠ和XhoⅠ）和测序证明构建正确;目标蛋白以可溶形式存在于宿主菌周质间隙,表达量为10%-15%;经纯化后,重组蛋白纯度达95%以上,等电点在4.55-6.20之间,相对分子质量和N-末端氨基酸序列均与白喉毒素相符合。结论成功分泌性表达并纯化了重组白喉毒素无毒突变体H21G蛋白,为下一步开发以重组H21G蛋白为基础的疫苗奠定了基础。; 范锋锋李燕婷金鑫刘月萍吴朝今冯宜扬乔瑞洁许博赵志强谭小梅谢贵林; 关键词：白喉毒素分泌性表达纯化

B 群脑膜炎球菌荚膜多糖分子大小分布和结构特性分析: 2014年; 目的：分析B群脑膜炎球菌荚膜多糖的分子大小分布和结构特性，为B群多糖类疫苗的研制提供理论依据。方法 Sepharose CL-4B柱层析分析B群荚膜多糖分子大小分布；基质辅助激光解吸附电离-飞行时间质谱（ matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry ，MALDI-TOF-MS）分析B群荚膜多糖重复单位相对分子质量；以C群荚膜多糖及唾液酸为对照，用核磁共振（ Nu-clear magnetic resonance ， NMR）法分析B群荚膜多糖的结构，通过各特征质子的化学位移分析其结构特征。结果15株B群菌株的粗制荚膜多糖分配系数K D值在0．60～0．76之间；重复单位相对分子质量为284，与其理论重复单位相对分子质量284一致。 B群荚膜多糖是由唾液酸为重复单位组成的，为2→8键连接，其中不含O-乙酰基修饰。结论 B群脑膜炎球菌荚膜多糖相对分子质量较小，这可能是引起其弱免疫原性的重要因素。通过NMR法能够实现对B群荚膜多糖结构的快速、准确分析。; 赵志强杨英英于旭博冯宜扬李阿妮方红春乔瑞洁吴兵刘方蕾谢贵林; 关键词：B群脑膜炎球菌荚膜多糖

伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗原液稳定性研究被引量：2: 2017年; 目的评价伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗原液的稳定性,为该疫苗原液的制备、储存提供有力的数据支持。方法选取3批伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗原液分别放置于(37±2)℃、(25±2)℃和2~8℃温度下,根据稳定性研究方案定期取样,对其主要评价指标(多糖含量、结合物含量、相对分子质量、鉴别试验)进行检测,评估疫苗原液的稳定性。结果伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗原液于2~8℃放置22个月,(25±2)℃放置52 w,(37±2)℃放置24 w时,各项主要评价指标均符合其质量标准的要求。结论伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗原液稳定性良好,在2~8℃可稳定存放22个月。; 刘月萍周海飞罗树权许博冯宜扬谢贵林谭小梅; 关键词：结合疫苗原液稳定性温度

重组铜绿假单胞菌外毒素A工程菌的高密度发酵与表达: 2011年; 高密度培养表达大肠杆菌生产重组铜绿假单胞菌外毒素A(rEPA)。用上海高机公司的30L自控发酵罐,采用分批补料培养技术,维持葡萄糖的浓度始终处于较低的水平,并分批补加氮源,同时溶氧控制在30%～40%,pH自动调控至7.0,培养至对数中期进行诱导。重组菌最终发酵液光密度(A600)未诱导时达到44,诱导时达到36,在上清液中表达的rEPA蛋白的含量占总蛋白的28.1%,在菌体中表达蛋白含量占总蛋白的4.7%。本实验为rE-PA的大规模生产奠定了基础。; 董勇前宣俊文冯宜扬丁浩范锋锋胡海涛赵志强

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冯宜扬

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