许洪芝
- 作品数：50 被引量：212H指数：8
- 供职机构：山东大学公共卫生学院病毒学研究室更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金山东省卫生厅科技基金国家教育部博士点基金更多>>
- 相关领域：医药卫生化学工程更多>>
- 新城疫病毒F蛋白细胞融合活性位点中保守氨基酸基因突变分析被引量：11
- 2006年
- 为了确定新城疫病毒融合蛋白(F)分子上活性位点中保守氨基酸在F蛋白的细胞融合作用,弄清F细胞融合的分子机理,采用基因定点突变法,创造一个酶切位点,用酶切反应初步筛选突变株,然后用DNA序列分析进一步确定,并于真核细胞内进行表达,Giemsa染色定性和指示基因法定量检测细胞融合功能,荧光强度分析(FACS)检测表达效率情况。结果表明,NDV F第117位苯丙氨酸(F)突变成亮氨酸(L)时对细胞融合作用没有显著影响。R112和K115同为保守序列,分别突变为G时,细胞融合活性只有原来的44%,下降了56%。细胞表面表达效率没有明显的改变。N147突变为K时,细胞融合活性明显下降,只有原来的15%,而细胞表面表达效率没有明显的改变。L154为保守序列,突变为K时,细胞融合活性消失,说明L154是一个非常关键的氨基酸,对维持F蛋白的细胞融合活性非常重要。细胞表面表达效率也有所下降(为原来的94%)。D462属于高度保守氨基酸,当突变为N时,细胞融合活性消失,但经细胞表面表达效率分析证明,此突变蛋白未表达于细胞表面,证明在细胞浆转运至细胞表面的过程中发生了问题。当突变为R和E时,细胞融合活性未发生改变,但细胞表面表达效率有所下降,分别为野毒株的63%和44%。说明NDV F分子上与HN相互作用的特异性区域中的某些保守氨基酸在细胞融合中发挥着重要作用,对F蛋白的折叠、加工、转运等,发挥着不同作用,从而影响F蛋白的细胞融合作用和/或在细胞表面的表达量。
- 王志玉任桂杰温红玲宋艳艳王桂亭姚苹许洪芝张文强
- 关键词：副粘病毒融合蛋白细胞融合基因新城疫病毒
- SARS病毒E蛋白基因与EGFP基因在BHK-21细胞中的融合表达被引量：1
- 2004年
- 目的:构建SARS病毒E蛋白基因的真核表达载体,观察E蛋白基因在BHK鄄21细胞中的正常表达及定位。方法:用PCR方法扩增E蛋白基因,上、下游引物两端分别设计EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点,产物双酶切后定向克隆于pEGFP鄄N1载体,构建真核表达载体pEGFP鄄E,脂质体法转染BHK鄄21细胞,荧光显微镜观察E蛋白基因的表达。结果:经酶切和DNA序列测定鉴定,E蛋白基因正确插入到增强绿荧光蛋白EGFP基因上游,荧光显微镜显示E蛋白表达于细胞浆内,包膜上也有分布。结论:在BHK鄄21细胞中成功表达了SARSCovE鄄EGFP融合蛋白,蛋白定位于细胞浆内。
- 陶泽新王志玉温红玲任桂杰宋艳艳王桂亭姚苹许洪芝
- 关键词：严重急性呼吸道综合征E蛋白转染
- 风疹病毒JR23株包膜糖蛋白的基因克隆、表达与功能分析
- 王志玉温红玲宋艳艳姚苹方朝凤王小凡许洪芝薛永磊
- 该课题的研究不仅扩增出了RV JR23株包膜糖蛋白E1和E2的基因，而且对它们的序列进行了分析，并与世界流行株做了比较研究，阐明它们的分子流行病学特征，构建了表达载体，建立了真核细胞瞬时表达体系。此表达体系成功地用于RV...
- 关键词：
- 关键词：风疹病毒基因克隆
- 单纯疱疹病毒I型糖蛋白D酵母表达载体的构建被引量：3
- 2003年
- 目的:构建含有单纯疱疹病毒I型包膜糖蛋白D全基因片段的克隆载体及酵母表达载体,为进一步真核表达重组gD蛋白奠定基础。方法:应用PCR方法从HSV-I基因组中扩增糖蛋白D的全长基因,产物回收后与pMD-18T载体连接,并转化,经氨苄筛选及测序,建立克隆载体pMD18T-gD;克隆载体与表达载体双酶切后,产物连接、转化大肠杆菌JM109,筛选、测序后确定构建了酵母表达载体pGAPZαA-gD。结果:重组质粒pMD18T-gD和pGAPZαA-gD经PCR和酶切均出现相应长度的片段,测序结果证实为gD基因,序列分析同源性为99.66%。结论:成功构建了含有单纯疱疹病毒I型糖蛋白D全基因的克隆载体及酵母表达质粒。
- 王战勇王志玉温红玲宋艳艳王桂亭许洪芝
- 关键词：单纯疱疹病毒糖蛋白D克隆酵母菌
- 汉坦病毒GM04-38株包膜糖蛋白上融合肽的初步确定被引量：1
- 2009年
- 目的初步确定汉坦病毒GM04-38株包膜糖蛋白上潜在的融合肽区域。方法采用基因定点突变技术将潜在融合肽区域的十个关键氨基酸突变成性质相左的氨基酸,转染Vero E6细胞后,间接免疫荧光(IFA)检测糖蛋白表达,采用Giemsa染色法观察细胞融合现象。结果在Vero E6细胞中成功表达出糖蛋白,IFA显示关键氨基酸突变前后细胞中均有荧光信号,呈胞浆分布,但细胞融合现象在突变后消失。结论潜在融合肽区域的十个氨基酸突变均对细胞融合产生明显的影响,提示该段区域很可能是病毒的融合肽。
- 曹海霞陶泽新郑晓民刘晓丽王桂亭许洪芝温红玲宋艳艳赵丽姚苹王志玉
- 关键词：汉坦病毒包膜糖蛋白细胞融合融合肽
- 艾滋病痴呆综合征病人HIV-1tat基因多态性及氨基酸序列分析被引量：2
- 2011年
- 目的 研究艾滋病痴呆综合征患者体内HIV-1 tat第一外显子基因序列的特征和变异情况,为艾滋病痴呆综合征发病机制的研究提供依据.方法 提取1例艾滋病痴呆综合征病例尸检标本的外周组织（淋巴结、脾脏）和中枢神经组织（脑膜、额叶灰质、额叶白质、颞叶、基底核）共7个部位的基因组DNA,巢式PCR扩增HIV-1 tat第一外显子基因,与克隆载体pGEM-T连接,经转化、氨苄青霉素和蓝白斑筛选出阳性克隆,每个部位挑取5个菌落测序,测序结果利用BioEdit、MEGA4软件比对并生成系统进化树、计算基因距离和同义/非同义替换值（ds/dn）,分析氨基酸位点的改变.结果 该病例感染的病毒是HIV-1 B亚型,分离自不同组织的HIV-1 tat第一外显子基因序列存在差异;与标准序列相比,该病例的HIV-1tat第一外显子基因编码的氨基酸序列有16个位点发生了变异,并且中枢各部位部分氨基酸位点的变异与外周不同,特别是中枢基底核5个序列及颞叶1个序列Q54R的变异值得关注.结论 艾滋病痴呆综合征患者体内,HIV-1 tat第一外显子序列与标准序列存在差异,并且在外周和中枢不同部位中存在的变异不同,这些变异是否与艾滋病痴呆综合征的发病机制有关,还有待进一步研究.
- 蒲双双闫玉芬高文花温红玲王志玉宋艳艳许洪芝赵丽
- 关键词：HIV-1TAT基因多态性氨基酸序列
- 抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆抗体的制备及鉴定被引量：7
- 2010年
- 目的制备抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)单克隆抗体(McAb)并对其进行初步鉴定。方法采用小剂量长周期的免疫方案,以DON-牛血清白蛋白(BSA)偶联物免疫雌性BALB/c小鼠,采用细胞融合的方法制备杂交瘤细胞株,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测上清中McAb,对抗体分泌阳性的细胞株进行克隆化,直至抗体阳性率100%,用竞争抑制ELISA法进一步检测McAb的特异性,腹水诱生法制备大量McAb,并用饱和硫酸铵对其进行纯化,用抗体亚类鉴定试剂盒对该McAb亚类进行鉴定,BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白含量,ELISA检测McAb的滴度、参考工作稀释度和亲和常数。结果 DON-BSA免疫的BALB/c小鼠血清效价为1∶256000,与BSA有强烈的交叉反应。细胞融合后,ELISA筛选抗体分泌阳性的杂交瘤细胞株,经3轮克隆化,建立了1株能稳定分泌抗DON-BSAMcAb的杂交瘤细胞株3G5,腹水诱生法制备了大量的McAb。该McAb属IgG1,IgG含量为6.06g/L,抗体滴度为1∶500000,参考工作稀释度为1∶64000,抗体亲和常数为1.62×109。用间接竞争抑制ELISA测得校正曲线线性范围9.8～10000ng/mL,线性方程Y=-0.2726X+0.2259(r=0.9309)。结论获得了分泌抗DON-McAb的杂交瘤细胞株,该单克隆抗体灵敏度高,特异性强,可用于制备高质量国产DON-ELISA检测试剂盒。
- 赵丽温红玲侯霄煜蒲双双宋艳艳许洪芝李凤琴
- 关键词：脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆抗体
- 风疹病毒E1—374糖蛋白生物活性检测及其初步应用被引量：1
- 2013年
- 目的分泌表达风疹病毒E1-374糖蛋白并检测其免疫原性。方法将E1—374蛋白的cDNA插入表达载体pGAPZotA中构建出表达质粒pGAPZctA—E1—374，经BlnI酶线性化后通过电转的方法导入毕赤酵母菌，博来霉素筛选阳性菌落。间接免疫荧光和WesternBlot检测E1—374蛋白的表达及免疫反应性。免疫小鼠后应用间接ELISA检测风疹病毒IgG抗体。结果SDS-PAGE和WesternBlot显示E1-374蛋白的相对分子质量为46．89×10^3。ELISA法检测免疫小鼠的抗血清为阳性。建立的间接ELISA方法的最佳工作条件是抗原包被浓度为5．5μg／ml，血清最佳稀释度为1：100，板内变异系数值为0．36％-12．45％。结论E1-374蛋白能够引起小鼠体液免疫应答，是风疹亚单位疫苗的重要候选成分，并可应用于风疹病毒IgG抗体的检测。
- 李振梅温红玲林彬孙成玺褚福禄袁晓晶宋艳艳许洪芝王志玉
- 关键词：风疹病毒毕赤酵母酶联免疫吸附测定
- 艾滋病痴呆综合征患者HIV-1B gp120基因的克隆及真核表达
- 2012年
- 目的克隆艾滋病痴呆综合征（ADC）患者体内不同部位的HIV-1Bgpl20基因，并在人神经胶质瘤细胞U87中表达。方法分别以一例ADC患者尸检标本的外周（淋巴结）和中枢（脉络丛、大脑枕叶白质）来源的基因组DNA为模板，PCR扩增HIV-1gp120基因，序列测定后，将目的基因插入表达载体pcDNA3．1（＋），构建重组表达载体gp120／peDNA3．1（＋），将所构建的重组表达载体用脂质体法转染人神经胶质瘤U87细胞，间接免疫荧光法测定HIV-1Bgp120的表达情况。结果克隆了ADC患者体内外周淋巴结、脉络丛、大脑枕叶白质3个部位的HIV-1Bgp120基因，所构建的表达质粒gp120／pcDNA3．1（＋）转染U87细胞后可表达目的蛋白。结论ADC患者不同部位来源的HIV-1Bgp120基因均可在U87细胞中表达，为进一步研究HIV-1Bgp120包膜蛋白的神经毒性及其作用机制提供条件。
- 赵丽闫玉芬李静蒲双双王志玉温红玲宋艳艳许洪芝
- 关键词：获得性免疫缺陷综合征HIV-1
- 外周血淋巴细胞携带风疹抗原与中枢神经感染风疹病毒的关系被引量：1
- 2000年
- 目的 探讨外周血淋巴细胞携带风疹病毒抗原与风疹病毒感染中枢神经系统的关系。方法 BALB/c小鼠分别给予临床常用的可影响机体免疫功能的药物 ,再经腹腔感染风疹病毒 ,并在感染后的 1、3、7、14d观察外周血淋巴细胞携带病毒抗原的情况 ,分析其与中枢神经系统病毒感染的关系。结果 地塞米松药物组在不同时间抗原的平均携带率分别为 3 1%、4 1%、9 6 %、2 4% ,环磷酰胺药物组分别为 14 2 %、12 7%、9 9%、3 1% ,未用药物干预的感染组分别为 4 6 3 %、10 2 5 %、6 88%、1 75 %。方差分析显示 ,3组动物在感染风疹病毒后的第 2 4小时外周血淋巴细胞携带抗原存在明显差异 ,F =0 0 317,P <0 0 5。组间两两比较结果显示 :环磷酰胺药物组动物外周血淋巴细胞抗原的携带明显高于其它实验动物组 ,地塞米松药物组和药物未干预组动物之间无明显差异。确切概率法分析表明 ,动物外周血淋巴细胞风疹病毒的持续性携带与中枢神经系统风疹病毒感染的关系极为密切 ,P <0 0 0 1。结论 环磷酰胺可能影响风疹病毒感染后外周血淋巴细胞对病毒的携带率。在感染初期 。
- 姚苹宋艳艳许洪芝王桂亭刘言训王志玉
- 关键词：外周血淋巴细胞风疹病毒中枢神经感染
