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卵巢癌相关抗原CA125单克隆抗体的制备: 2013年; 目的制备卵巢癌相关抗原CA125R单克隆抗体,并进行鉴定。方法将CA125一段串联重复序列(CA125R)基因克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,构建重组表达质粒pGEX-CA125R,转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3),IPTG诱导表达GST-CA125R融合蛋白。表达的融合蛋白经GST亲和层析柱纯化后,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备CA125单克隆抗体,Western blot法鉴定抗体的特异性,单克隆抗体亚类测定试剂盒分析单抗的亚类。腹水诱生法大量制备单抗,SDS-PAGE分析单抗的纯度,间接ELISA法检测单抗的效价。结果重组原核表达质粒pGEX-CA125R经双酶切及测序,证实构建正确;纯化的GST-CA125R融合蛋白相对分子质量约44 000,纯度约为95%,可与小鼠抗GST单克隆抗体发生特异性反应;获得1株可稳定分泌抗CA125单克隆抗体的杂交瘤细胞株3-B2,其分泌的单抗能特异识别GST-CA125R融合蛋白和天然CA125糖蛋白,其抗体亚型为IgG2a型;纯化的腹水单抗纯度约为90%,效价达1×106以上。结论成功获得1株能特异性识别天然CA125糖蛋白的单克隆抗体细胞株,并经腹水诱生法大量制备了抗体,为CA125临床检测试剂盒的研发奠定了基础。; 梁勤东马婷婷董晋豫李武县汪先桃李紫微王秦熊海玉涂植光; 关键词：卵巢癌肿瘤相关抗原 CA125 单克隆抗体

重组腺病毒Ad5-hNK4-EGFP的构建与鉴定被引量：3: 2012年; 目的构建携带绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)标签和hNK4基因的重组腺病毒Ad5-hNK4-EGFP,并检测其对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响。方法以pcDNA3/hNK4质粒为模板,采用高保真DNA聚合酶扩增hNK4基因,克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建重组穿梭质粒pAdTrack-hNK4,穿梭质粒经PmeⅠ酶切线性化,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,获得重组腺病毒质粒pAd5-hNK4-EGFP,经PacⅠ酶切线性化后转染AD-293细胞进行包装,获得重组腺病毒Ad5-hNK4-EGFP,经4轮扩增后,测定病毒滴度;将重组腺病毒感染AD-293细胞,采用RT-PCR及Western blot法检测感染细胞中NK4基因的转录及蛋白的表达;MTT法检测Ad5-hNK4-EGFP对肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)诱导的MDA-MB-231细胞增殖的影响。结果重组腺病毒质粒pAd5-hNK4-EGFP经PacⅠ酶切鉴定证明构建正确;经包装及4轮扩增后,重组腺病毒Ad5-hNK4-EGFP的滴度可达1.5×1011PFU/ml;经RT-PCR及Western blot鉴定表明,重组腺病毒携带的NK4基因能够在AD-293细胞中表达;HGF可促进MDA-MB-231细胞增殖,而Ad5-hNK4-EGFP可拮抗HGF诱导的MDA-MB-231细胞增殖。结论成功构建了表达hNK4基因的重组腺病毒Ad5-hNK4-EGFP,其可拮抗HGF诱导的MDA-MB-231细胞的增殖,为进一步深入研究HGF和NK4的功能、相互作用及作用机制奠定了基础,也为乳腺癌的靶向基因治疗提供了一个新的靶点。; 匡文斌成凤秦晓林范晓卿王秦董晋豫梁勤东涂植光; 关键词：腺病毒肝细胞生长因子 NK4

Ad5F35-GFP、Ad5-GFP及Lipofectamine^(TM) 2000对4种细胞转染效率的比较被引量：2: 2012年; 目的将腺病毒Ad5F35-GFP、Ad5-GFP及LipofectamineTM2000对4种细胞的转染效率进行比较,以获得Ad5F35-GFP适用的细胞种类及各类细胞适用的转染方法。方法采用携带绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)基因的Ad5F35-GFP、Ad5-GFP及LipofectamineTM2000,分别转染人慢性粒细胞白血病细胞K562、人外周血单个核细胞(PBMC)、小鼠脂肪细胞3T3-L1和肝癌细胞Hep A1-6,于转染48 h后,倒置荧光显微镜下观察转染效率,RT-PCR法检测GFP基因mRNA的转录水平。结果 Ad5F35-GFP转染K562细胞、PBMC效率均较高,分别为61%和56%,但不能有效地转染3T3-L1(5%)、HepA1-6(15%)细胞;Ad5F35-GFP、Ad5-GFP及LipofectamineTM2000均不能有效地转染3T3-L1细胞,转染效率分别为5%、5%和6%;Ad5-GFP、LipofectamineTM2000转染Hep A1-6细胞效率均较高,分别为73%和71%。结论 Ad5F35-GFP可有效转染人造血细胞和单核细胞,为相关基因的研究及治疗领域的应用奠定了基础。; 成凤王秦匡文斌李朴董晋豫梁勤东涂植光; 关键词：腺病毒转染效率

Y盒结合蛋白1单克隆抗体的研制、表位测定及其免疫学应用被引量：5: 2012年; 建立稳定分泌抗人Y盒结合蛋白1单克隆抗体(anti-YB-1 mAb)的杂交瘤细胞株,鉴定其表位与免疫学应用。将重组YB-1蛋白免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合。经ELISA法筛选鉴定、定株后采用腹水诱生法制备anti-YB-1 mAb;Protein G亲和层析法纯化mAb,ELISA法测定mAb效价、亚型及相对亲和力。采用抗原表位预测法鉴定anti-YB-1 mAb识别表位所在区域。Western blot和免疫组化鉴定mAb识别内源性YB-1的特异性。经筛选鉴定获得2株稳定分泌anti-YB-1 mAb的杂交瘤细胞(1-D9,3-E8);腹水抗体效价均≥1×10-6,亚型均为IgGl;1-D9和3-E8单抗识别表位分别位于(134-160aa)与(266-303aa)肽段。Western blot、免疫组化结果证实anti-YB-1 mAb能特异性识别内源性YB-1。该研究为YB-1免疫学定性、定量检测方法的建立、肿瘤靶向抗体治疗及进一步探讨YB-1的生物学功能奠定了基础。; 李朴史静成凤梁勤东匡文斌王秦董晋豫涂植光; 关键词：YB-1 单克隆抗体抗原表位免疫学检测

环氧化酶-2基因shRNA重组腺病毒的构建及鉴定: 2013年; 目的构建携带增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)标签的环氧化酶-2(cyclooxyge-nase-2,COX-2)基因shRNA重组腺病毒,并观察其对肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响。方法将前期构建的真核表达质粒pGenesil-1-COX-2-shRNA及阴性对照质粒pGenesil-1-HK的表达启动子U6及shRNA序列亚克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack中,构建重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-U6-COX-2-shRNA-EGFP和pAdTrack-U6-HK-EGFP,酶切及测序鉴定正确后,经PmeⅠ线性化,转化感受态AdEasier,构建重组腺病毒质粒pAd-U6-COX-2-shRNA-EGFP和pAd-U6-HK-EGFP,经PacⅠ线性化,转染AD293细胞,包装重组腺病毒Ad-U6-COX-2-shRNA-EGFP和Ad-U6-HK-EGFP,经3轮扩增后,测定滴度。RT-PCR和Western blot法检测感染细胞中COX-2基因mRNA的转录及蛋白的表达,MTS法观察重组腺病毒对肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响。结果重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-U6-COX-2-shRNA-EGFP和pAdTrack-U6-HK-EGFP及重组腺病毒质粒pAd-U6-COX-2-shRNA-EGFP和pAd-U6-HK-EGFP经酶切和测序鉴定均构建正确,并成功转染AD293细胞,经包装和3轮扩增后,重组腺病毒Ad-U6-COX-2-shRNA-EGFP和Ad-U6-HK-EGFP的滴度分别为1.4×1012和2.0×1012pfu/ml。重组腺病毒感染的SMMC-7721细胞中COX-2基因mRNA、蛋白相对表达量及细胞增殖能力均明显低于空白对照组及阴性对照组(P均<0.05)。结论成功构建了COX-2基因shRNA重组腺病毒Ad-U6-COX-2-shRNA-EGFP,且可显著抑制肝癌细胞SMMC-7721的增殖,为进一步研究COX-2作为肝癌基因治疗靶点及机制奠定了基础。; 董晋豫王秦梁勤东李武县马婷婷熊海玉李紫微涂植光; 关键词：环氧化酶-2基因短发夹RNA 腺病毒基因治疗

卵巢癌相关抗原CA125串联重复序列的原核表达纯化及抗血清制备被引量：1: 2012年; 目的:建立CA125串联重复序列(CA125R)原核表达系统,表达纯化重组CA125R蛋白并制备其抗血清。方法:全基因合成一段CA125串联重复序列,并将其克隆至pET-32a(+),构建CA125R蛋白原核表达载体pET-CA125R;将构建好的pET-CA125R载体转化至E.coli BL21(DE3),确定最佳可溶性表达条件,通过Ni-NTA亲和层析系统纯化重组CA125R蛋白;纯化重组蛋白经Western blot方法验证后,免疫家兔制备抗血清。结果:成功构建CA125串联重复序列原核表达载体,确定了最佳可溶性诱导表达条件(0.5 mmol/LIPTG,15℃诱导6 h);Western blot结果证实纯化的重组蛋白正确,纯度高;制备的抗血清能特异识别重组CA125R蛋白和天然CA125糖蛋白。结论:成功建立了CA125R高效原核表达系统,并制备了高纯度重组CA125R蛋白及其抗血清。; 梁勤东郭变琴汪仙桃李武县董晋豫王秦涂植光; 关键词：CA125 原核表达抗血清制备

卵巢癌细胞与巨噬细胞共培养对B7-H1表达的影响及机制被引量：4: 2013年; 为了探讨卵巢癌细胞与巨噬细胞共培养后对B7-H1表达的影响及其可能机制,利用佛波酯(PMA)诱导THP-1或外周血单核细胞分化为巨噬细胞后,与人卵巢癌细胞株SKOV3体外非接触共培养24 h,qRT-PCR、Western blot以及流式细胞术分别检测SKOV3与巨噬细胞B7-H1的表达;进一步利用NF-κB、JAK2/STAT3、p38 MAPK信号通路的抑制剂作用于共培养体系,检测B7-H1表达的变化,以探讨其机制。结果显示,共培养24 h后,SKOV3及巨噬细胞B7-H1 mRNA和蛋白的表达较非共培养组均显著升高(P<0.05),而阻断NF-κB、JAK2/STAT3、p38 MAPK信号通路后,B7-H1的上调均明显被抑制(P<0.05)。SKOV3与巨噬细胞共培养后B7-H1的表达升高(P<0.05),其机制可能涉及到NF-κB、JAK2/STAT3、p38 MAPK信号通路的激活。; 熊海玉马婷婷王秦董晋豫梁勤东李紫微张维理涂植光; 关键词：卵巢癌 B7-H1 肿瘤相关巨噬细胞

携人IL-12基因腺病毒的构建及其对Hep3B细胞增殖及TGF-β表达的影响被引量：7: 2012年; 目的:构建携带人IL-12的重组腺病毒,观察其对Hep3B增殖及TGF-β表达的影响。方法:PCR扩增IL-12基因,构建穿梭质粒pAdTrack-IL-12;穿梭质粒经Pme I线性化后转化AdEasier Cell,E.coli BJ5183内同源重组;PacⅠ酶切重组腺病毒质粒,转染AD293,包装病毒;病毒pAd-IL-12感染肝癌细胞Hep3B,以RT-PCR、Western blot检测白介素12的表达;MTT法检测肝癌细胞的增殖情况;RT-PCR检测转化生长因子-β(TGF-β)的表达。结果:成功构建携IL-12基因的重组质粒,并成功包装可高效感染Hep3B的腺病毒pAd-IL-12;RT-PCR以及Western blot结果表明,病毒pAd-IL-12感染Hep3B后可高表达白介素12,并且与对照组相比Hep3B增殖能力显著降低(P<0.05),TGF-β表达量也降低(P<0.05)。结论:可高表达IL-12的腺病毒包装成功,感染肝癌细胞Hep3B后抑制其增殖,同时也下调TGF-β的表达,为进一步研究IL-12的肿瘤治疗作用奠定了基础。; 成凤匡文斌王秦秦晓林范晓卿董晋豫梁勤东李朴涂植光; 关键词：白介素12 细胞增殖

shRNA靶向干扰COX-2稳定细胞系的建立及鉴定: 2013年; 脂质体法将COX-2-shRNA载体转染肝癌细胞株SMMC-7721,G418筛选获得稳定细胞系COX-2-shRNA-SMMC-7721,通过RT-PCR和Western blot分别检测细胞系中COX-2基因mRNA转录水平和蛋白质表达水平,通过MTT、流式细胞术和Transwell等观察细胞恶性生物学行为的改变。建立COX-2-shRNA-SMMC-7721(干扰组)、HK-SMMC-7721(阴性对照组)细胞株。干扰组的COX-2基因mRNA的转录水平、蛋白表达水平和细胞增殖能力较阴性对照组和SMMC-7721(空白组)明显下降(P<0.05),而阴性对照组与空白组间无明显差异(P>0.05);干扰组、阴性对照组和空白组处于G0/G1期的细胞分别为(68.85±0.27)%、(53.05±0.35)%和(53.54±0.33)%;细胞凋亡率分别为(9.60±0.20)%、(1.79±0.23)%和(1.75±0.20)%;穿膜细胞数分别为(117.60±5.30)、(338.40±11.50)和(347.40±12.80)个。干扰组与阴性对照组和空白组有显著差异(P<0.05),而阴性对照组与空白组间无明显差异(P>0.05)。利用RNA干扰技术成功构建了靶向干扰COX-2的稳定肝癌细胞系COX-2-shRNA-SMMC-7721,为COX-2分子的作用机制研究提供了细胞模型。; 汪先桃董晋豫郭变琴马婷婷熊海玉涂植光; 关键词：COX-2 SHRNA 稳定细胞系肝癌

重组腺病毒Ad5F35-IL-12感染不同单核-巨噬细胞的研究被引量：2: 2013年; 目的确定人IL-12基因重组腺病毒Ad5F35-IL-12在不同人单核-巨噬细胞中的表达。方法将人IL-12基因重组腺病毒Ad5F35-IL-12分别感染人外周血单个核细胞、胸水巨噬细胞,以及THP-1和U937单核细胞株及其经佛波酯(PMA)诱导后生成的巨噬细胞;感染48 h后荧光显微镜观察对相应细胞的感染效率,RT-PCR检测IL-12双亚基p35和p40的mRNA表达情况,ELISA检测细胞培养上清中IL-12p70的分泌水平。结果人IL-12基因重组腺病毒Ad5F35-IL-12可成功感染人外周血单个核细胞、胸水巨噬细胞以及THP-1和U937单核细胞株及其PMA诱导后生成的巨噬细胞,并分泌IL-12 p70蛋白,蛋白表达量从高至低依次是胸水巨噬细胞、PMA诱导后U937细胞、PMA诱导后THP-1细胞、U937细胞、外周血单个核细胞、THP-1细胞。结论人IL-12基因重组腺病毒Ad5F35-IL-12可以感染不同的单核-巨噬细胞,并成功表达分泌IL-12 p70蛋白。; 王秦成凤张维理匡文斌李朴董晋豫梁勤东涂植光; 关键词：IL-12 单核巨噬细胞基因治疗

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董晋豫

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