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小鼠血清中杀O139霍乱弧菌抗体检测方法的初步建立: 2014年; 目的研究探索O139霍乱弧菌杀弧菌抗体的检测方法。方法用微孔板培养和琼脂平板克隆计数相结合的杀弧菌抗体检测方法,对实验菌株及稀释度、补体浓度等关键参数进行筛选;对50份小鼠免疫血清进行杀弧菌抗体滴度检测,并与O139群霍乱弧菌LPS Ig G抗体滴度进行相关分析;对该方法的特异性、线性和精密性进行了验证。结果筛选出最佳菌株为20100603菌株,最佳稀释度倍数为2 000倍,补体最佳稀释倍数为16倍。O139群霍乱弧菌小鼠免疫血清检测到较高的杀弧菌抗体滴度而PBS小鼠免疫血清未检测到杀弧菌抗体滴度。小鼠免疫血清杀弧菌抗体滴度与O139群霍乱弧菌LPS Ig G抗体滴度之间存在正相关关系。验证结果显示,在抑制剂浓度达到1.0～2.0 A600时,抑制率100%;线性回归方程为y=-1.093x＋5.058,其相关系数为-0.999,P〈0.05;方法批内CV值为15.72%,批间CV值为23.47%。结论初步建立了O139霍乱弧菌杀弧菌抗体的检测方法,该方法具有较高的特异性、线性和精密度。; 范锋锋谭小梅李燕婷吴朝今刘月萍乔瑞洁王浩赵志强谢贵林; 关键词：霍乱霍乱弧菌 O139 滴度

不同剂量伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗在小鼠体内诱导的抗体水平分析: 2015年; 目的研究伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗免疫效果及不同剂量伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗在小鼠体内诱导的抗体水平,以确定合适的免疫剂量。方法将150只清洁级NIH雌性小鼠随机分为5组,分别为A组(0.625μg结合疫苗组)、B组(1.250μg结合疫苗组)、C组(2.500μg结合疫苗组)、D组(2.500μg多糖组)及阴性组(10mmol/L PBS),每组30只;另领取10只为空白对照(不接种)。A、B、C、D组及阴性组小鼠经腹股沟皮下注射,剂量0.1 m L/只,每隔2周免疫1次,共免疫3次,每次免疫后第7天采血。采用ELISA检测小鼠血清抗体效价,同时对不同剂量伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗在小鼠体内诱导的抗体效价进行分析比较。结果与D组相比,A、B、C三组诱导的抗体水平与之均有统计学意义(P<0.05);A组与B组、A组与C组之间的抗体水平也具有统计学意义(P<0.05),而B组与C组之间的抗体水平无统计学意义(P>0.05)。说明与多糖疫苗相比,伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗能够诱导更高的抗体水平,且具有明显的剂次加强效应。同时证明1.250μg的伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗可诱导与2.500μg伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗相同的抗体水平。结论伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗的两种免疫剂量在小鼠体内可诱导相同的抗体水平,在选择接种剂量时,可致免疫应答的无统计学意义的低剂量可能是较为经济和安全的选择。; 刘月萍罗树权冯宜扬冯琪蓉金鑫周晖国周海飞谢贵林谭小梅; 关键词：伤寒沙门菌结合疫苗多糖免疫免疫剂量

重组铜绿假单胞菌外毒素A含量SDS-PAGE检测方法的建立及验证: 2016年; 目的建立测定重组铜绿假单胞菌外毒素A（recombinant exotoxin of Pseudomonas aeruginosa,r EPA）含量的SDSPAGE法,并进行验证。方法采用SDS-PAGE,经考马斯亮蓝R-250染色后,利用Image Lab软件分析获得目标蛋白条带光密度值,计算目标蛋白在待测样品中的含量。对建立的方法进行专属性、准确性和重复性验证,确定检测范围,并用建立的方法检测r EPA宿主湿菌体中r EPA发酵产量及r EPA宿主菌休克液柱层析纯化样品中r EPA含量。结果 r EPA含量在100~600μg/ml范围内与其对应条带的光密度值具有良好的相关性,决定系数在0.97以上。大肠埃希菌固有组分及纯化过程中常用的添加物对r EPA含量检测均未产生明显影响,专属性较好;用建立的方法检测500、300、150μg/ml r EPA样品10次的回收率分别为（102.32±4.18）%、（102.77±4.94）%和（95.04±16.41）%,CV值分别为4.08%、4.81%和17.27%。各批r EPA发酵产量为250~500 mg/L,三步柱层析纯化后,r EPA总回收率约为50%。结论建立了测定r EPA含量的SDS-PAGE法,该方法专属性、准确性和重复性良好,为r EPA生产工艺的优化奠定了基础。; 范锋锋李燕婷金鑫冯宜扬夏莲坤刘月萍朱衍志赵志强谢贵林谭小梅; 关键词：SDS-PAGE 收率

白喉毒素无毒突变体H21G蛋白的分泌性表达及纯化: 2016年; 目的原核分泌性表达白喉毒素无毒突变体H21G蛋白并进行纯化,为下一步开发以重组H21G蛋白为基础的疫苗奠定基础。方法以p ET16a-H21G质粒为模板,PCR扩增H21G基因,亚克隆至p ET22b载体中,构建重组原核表达质粒p ET22b-H21G,转化感受态大肠埃希菌BL21（DE3）,IPTG诱导重组H21G蛋白分泌性表达。重组蛋白经渗透压休克,DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和Phenyl Sepharose 6FF（high sub）疏水层析纯化后,使用还原/非还原SDS-PAGE和HPLC法分析纯化蛋白的纯度,窄范围等电聚焦分析其等电点,MALDI-TOF质谱法分析其相对分子质量,N-末端测序法鉴定N-末端氨基酸序列。结果重组原核分泌性表达质粒p ET22b-H21G经双酶切（NcoⅠ和XhoⅠ）和测序证明构建正确;目标蛋白以可溶形式存在于宿主菌周质间隙,表达量为10%-15%;经纯化后,重组蛋白纯度达95%以上,等电点在4.55-6.20之间,相对分子质量和N-末端氨基酸序列均与白喉毒素相符合。结论成功分泌性表达并纯化了重组白喉毒素无毒突变体H21G蛋白,为下一步开发以重组H21G蛋白为基础的疫苗奠定了基础。; 范锋锋李燕婷金鑫刘月萍吴朝今冯宜扬乔瑞洁许博赵志强谭小梅谢贵林; 关键词：白喉毒素分泌性表达纯化

b型流感嗜血杆菌结合物纯化过程不同部分的生化及免疫学特性被引量：3: 2006年; 目的分析Hib结合物纯化过程不同部分的生化及免疫学特性。方法制备的Hib结合物经SepharoseCL4B层析柱纯化,从中选5个不同位点取样,检测其生化特性及免疫原性。结果1、2和3部分多糖蛋白质比例在0.4左右,高分子结合物含量均在80%以上,经高压液相分析,这3部分的相对分子质量均在1400000以上,免疫小鼠后均能产生较好的免疫应答。第4部分高分子结合物含量在70%左右,相对分子质量约在670000,免疫小鼠后也能产生较好的免疫应答。第5部分高分子结合物含量为23.7%,相对分子质量在50000左右,基本是以游离状态存在的多糖和载体蛋白,免疫小鼠后仅能产生很低的免疫应答。结论1、2和3部分是Hib结合物纯化中需收集的部分,第4部分虽也以结合状态存在,但相对分子质量相对较低,第5部分主要是游离的多糖和蛋白质。; 杜琳谭小梅宣俊文蒋奕刘月萍谢贵林; 关键词：B型流感嗜血杆菌结合物生化特性免疫学特性

伤寒Vi结合疫苗的研究被引量：7: 2006年; 目的制备伤寒Vi结合疫苗并研究其特性。方法载体蛋白质重组铜绿假单胞菌外毒素A(rEPA)经ADH衍生后,与伤寒Vi多糖结合制备结合物,并对结合物进行化学特性和生物学特性的研究,尤其是研究结合物对小鼠的免疫原性。结果制备的伤寒Vi结合物相对分子质量(Mr)明显大于游离的伤寒Vi多糖和载体蛋白质,其多糖和蛋白质比值为1．2,结合物含量测定证明至少有70％的多糖是以结合状态存在,HPLC(TSK5000)的结果显示伤寒Vi结合物中Kd(partition coefficient)≤0．2占94％,内毒素含量、过敏原性、豚鼠和小鼠的动物毒性试验等都证明结合物安全,免疫双扩散试验证明结合物的多糖和蛋白质组分的抗原性都完好保持,在小鼠上的免疫原性试验证明结合物具有与单纯Vi多糖完全不同的免疫学特性,可以产生更高的特异性免疫应答,并具有明显的加强免疫效果。结论按试验设计方案制备的伤寒Ⅵ结合疫苗,经化学和生物学检测,证明结合物确以多糖蛋白质结合状态存在,并证实该结合物具有较好的生物安全性和免疫学效果。; 杜琳谭小梅蒋奕刘月萍谢贵林; 关键词：伤寒结合疫苗

液相色谱-ELISA测定结合疫苗中游离蛋白含量可行性的初步探讨被引量：1: 2008年; 用适宜分离范围的色谱柱,预先确定细菌多糖蛋白结合疫苗载体蛋白的洗脱峰出峰时间;然后将细菌多糖-蛋白结合疫苗用相同条件进行分离,分部收集各洗脱峰并直接包被酶标板,与适宜浓度的载体蛋白特异抗体反应后,加入酶标二抗测定各洗脱峰样品中载体蛋白的吸光值;把载体蛋白出峰后的吸光值总和计为游离载体蛋白质吸光值;以游离载体蛋白吸光值占所有洗脱峰吸光值的比例计算游离载体蛋白含量。以伤寒Vi结合疫苗(载体蛋白rEPA)和甲型副伤寒结合疫苗(载体蛋白为TT)作为实验材料探讨方法的可行性。结果说明,该方法具有较好的特异性和敏感度。; 谭小梅杨朝晖周园赵志强张萍刘月萍计永莉杜琳谢贵林; 关键词：结合疫苗 ELISA 液相色谱

人血清中抗伤寒Vi多糖特异IgG抗体含量ELISA检测方法的建立及验证被引量：3: 2015年; 目的建立测定人血清中抗伤寒Vi多糖特异Ig G抗体含量的ELISA方法,并进行验证。方法以美国国立卫生研究院（National Institutes of Health,NIH）测定Vi抗体的ELISA方法为主要参考,对包被抗原、不同吸附力酶标板、抗原包被浓度、样品反应条件、显色时间进行优化,建立测定人血清中抗伤寒Vi多糖Ig G抗体含量的ELISA方法,并对建立的方法进行特异性、线性、准确性、精密度、最低检测限验证。结果优化的ELISA法为：以伤寒Vi多糖作为包被抗原,costar92592型酶标板作为检测酶标板,2.0μg/ml为抗原包被浓度,20~25℃过夜为样品的反应条件,在40~80 min内（A405值在1.8~2.5之间）终止显色。质控血清经不同含量多糖吸收后,抗体含量与多糖浓度具有明显的浓度依赖关系,多糖抑制率最高可达92%;血清稀释度与抗体含量存在负相关的线性关系,R2=0.999;本试验检测的质控血清抗体浓度为76.80 EU/ml,变异系数（CV）=8.55%,与美国NIH检测的数据（75 EU/ml,CV≤15%）一致性良好;该方法重复性（CV≤15%）及中间精密度（CV≤20%）均符合要求;最低检测限为0.78 EU/ml。结论建立了人血清中抗伤寒Vi多糖特异Ig G抗体含量ELISA检测方法,该方法特异性、线性、准确性、精密度良好,可快速、准确地检测人血清中抗伤寒Vi多糖Ig G抗体含量。; 刘月萍范锋锋周海飞许博王欣茹金鑫赵志强祝秉东谢贵林谭小梅; 关键词：免疫球蛋白G 酶联免疫吸附测定

b型流感嗜血杆菌结合疫苗中载体蛋白质的效力研究被引量：1: 2007年; 考察b型流感嗜血杆菌(Hib)结合疫苗的载体蛋白质—破伤风类毒素(TT)的免疫原性,为百白破与Hib四联疫苗中TT的使用提供参考。方法:将小鼠随机分为四组,分别注射Hib结合疫苗、Hib与百白混合疫苗、Hib与百白破混合疫苗、破伤风类毒素,比较它们在NIH小鼠体内所诱导产生的特异性抗体水平,并对这四组疫苗进行破伤风效力保护试验。结果表明,破伤风类毒素组,Hib与百白破混合疫苗组刺激的TT抗体水平远大于Hib结合疫苗组和Hib与百白混合疫苗组。效力试验虽四组间没有差异,只说明一定的抗体量就可以对小鼠提供保护。认为Hib结合疫苗中的载体蛋白并不能替代百白破疫苗中的破伤风类毒素。; 谭小梅刘月萍朱亚萍张桓杜琳; 关键词：破伤风类毒素 HIB结合疫苗免疫原性

伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗原液稳定性研究被引量：2: 2017年; 目的评价伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗原液的稳定性,为该疫苗原液的制备、储存提供有力的数据支持。方法选取3批伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗原液分别放置于(37±2)℃、(25±2)℃和2~8℃温度下,根据稳定性研究方案定期取样,对其主要评价指标(多糖含量、结合物含量、相对分子质量、鉴别试验)进行检测,评估疫苗原液的稳定性。结果伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗原液于2~8℃放置22个月,(25±2)℃放置52 w,(37±2)℃放置24 w时,各项主要评价指标均符合其质量标准的要求。结论伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗原液稳定性良好,在2~8℃可稳定存放22个月。; 刘月萍周海飞罗树权许博冯宜扬谢贵林谭小梅; 关键词：结合疫苗原液稳定性温度

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刘月萍

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